编译：微科盟赵赵，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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导读
小麦籽粒的营养价值，特别是其蛋白质和代谢物的组成，是籽粒灌浆过程的结果，特别是在胚乳中。本研究利用激光显微切割技术( LMD )结合鸟枪法蛋白质组学和代谢组学技术，建立了小麦籽粒灌浆前期( 15 DAA )和后期( 26 DAA )（DAA：花后天数）胚乳发育过程中细胞类型特异性蛋白质组和代谢组数据库。我们从四种不同类型的细胞(糊粉层( AL )，亚糊粉层( SA )，淀粉胚乳( SE )和胚乳转移细胞( ETCs ) )中鉴定了1803个蛋白质和41个代谢物。在这两个时间点检测到的差异表达蛋白中，AL有67个，SA有31个，SE有27个，ETC有50个。特定的SUT和GLUT转运体、蔗糖转化酶和淀粉生物合成酶的细胞类型积累与相应的糖代谢产物有很好的相关性，这表明15 DAA时通过珠心突起和ETC的糖上传和淀粉积累, 而在26 DAA的后期则相反。AL、SA和ETC之间各种蛋白水平的变化支持了从15 到 26 DAA之间的这种代谢转换。蛋白质和代谢物的独特的空间和时间丰度揭示了从15 到 26 DAA不同细胞类型中谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和谷氨酸等氮同化途径活性的差异，这可能与胚乳*特中**定的蛋白质积累有关。细胞类型特异性蛋白质组和代谢组数据的整合揭示了籽粒发育和灌浆过程中不同细胞类型之间复杂的代谢相互作用和功能转换。
论文ID
原名： Cell-type proteomic and metabolomic resolution of early and late grain filling stages of wheat endosperm
译名： 小麦胚乳灌浆前期和后期的细胞型蛋白质组学和代谢组学解析
期刊： Plant Biotechnology Journal
IF： 13.8
发表时间： 2023.12
通讯作者： Palak Chaturvedi &Wolfram Weckwerth
通讯作者单位： 维也纳大学
实验设计
实验结果
1. 小麦籽粒发育过程中的形态、可溶性糖、蔗糖、总淀粉含量
籽粒鲜重( mg /粒)在花后30天之前随成熟度的增加而增加，然后下降(图1a )。鲜重的增加可以通过干物质积累和籽粒含水量的增加来解释。由于空腔液体在28 DAA后消失，预示着成熟阶段的开始，鲜重在30 DAA达到峰值后势必下降。为了解小麦籽粒内部同化物输入的规律，我们测定了发育籽粒( 7-28 DAA)、(图1c , d)的蔗糖、可溶性糖和总淀粉含量水平。可溶性糖和蔗糖含量在开花后立即增加，在开花后7 d达到最大值，然后下降，直到开花后28 d。此后，该水平几乎保持不变。籽粒在7 DAA时表现出少量淀粉。随后迅速增加，直至成熟期( 30 DAA )。活性淀粉的合成从14 DAA开始，一直持续到28 DAA。
在Zhang等的研究中，15 DAA和26 DAA被确定为籽粒灌浆过程中两个重要的转变时间点，其中15 DAA为中乳期，26 DAA为硬面期。此外，种子贮藏蛋白( SSPs )的空间分布最早出现在14 DAA，蛋白质积累开始迅速增加。在结构上，从花后24天( days post-anthesis , DPA )开始，淀粉颗粒周围的蛋白质基质可见，而不是单个蛋白体( PBs)。考虑到籽粒灌浆过程中同化物的调控作用，本研究选择15 DAA作为籽粒灌浆早、中期时间点，26 DAA作为籽粒灌浆后期时间点。所有记录的观察结果汇总在表S1中。
图1.籽粒发育动态及蔗糖、淀粉和可溶性糖含量。( a )籽粒发育过程中鲜重的变化。每个阶段至少分析了70粒。( b ) 15 ~ 26 DAA籽粒长度和宽度的变化。误差条表示3次重复的标准差。( c )发育籽粒可溶性糖和总淀粉含量。( d )籽粒发育过程中的蔗糖含量。误差棒表示4次生物学重复的标准误差。( e )使用Leica 激光显微解剖显微镜( LMD6500 )观察胚乳切片，放大310 μ m，从15 DAA开始。( f )使用Leica激光显微解剖显微镜( LMD6500 )观察胚乳切片，放大310 μ m，从26 DAA开始。AL，糊粉；DAA，开花后天数；ETCs，胚乳传递细胞；SA，sub -糊粉；SE，淀粉胚乳。
2. 利用激光显微切割( LMD )和鸟枪法蛋白质组学对糊粉层、亚糊粉层、淀粉胚乳和胚乳转移细胞进行细胞特异性蛋白质组表征
为了进行蛋白鉴定，将原始数据在小麦UniProt和IWGSC (国际小麦基因组测序联盟)数据库中进行检索(表S2 )。在这一阶段，此研究决定使用UniProt数据库，因为与IWGSC数据库相比较而言，UniProt数据库对肽段和各自蛋白序列的功能描述是一致的。从UniProt数据库中检测到的所有肽段中，考虑到至少在一种细胞类型中存在于所有3个生物学重复中的蛋白，进一步选择了1803个蛋白(表S3 )。使用蛋白质NSAF得分进行主成分分析( PCA )。第一主成分分离了胚乳细胞类型PC1，在15 DAA和26 DAA分别占62.98 %和60.63 %。PC1的正载荷代表ETCs中丰度较高的蛋白质，而负载荷代表AL中丰度较高的蛋白质(表S4 )。在15 DAA中，负载量最高的包括参与氨基酸代谢、CHO代谢、蛋白质合成和降解以及serpin (丝氨酸蛋白酶*制剂抑**)的蛋白。26 DDA负载量的蛋白质组调控包括参与RNA加工和转录调控的蛋白，丰度较高。15个DAA中正载荷最高的蛋白包括参与细胞壁降解、生长素调控、脂质代谢、蛋白质降解和RNA转录调控的蛋白。同样，在26 DAA中，最高的正载量揭示了参与细胞壁前体合成(胚胎发育晚期丰富蛋白D-34)、蛋白质合成和靶向的蛋白质。在26 DAA时，SA和SE之间的方差较小，表明在发育过程中，淀粉胚乳成为小麦籽粒的中心胚乳细胞(图2a )。
不同细胞类型( AL、SA、SE、ETCs)在发育阶段( 15和26 DAA)中蛋白质组的显著变化由Venn图(图2b ;表S5)来说明。在15和26 DAA时，分别有1114和615个蛋白在所有细胞类型中被共同鉴定。其中值得注意的是，仅在15 DAA的SA中鉴定到了两个独特的蛋白(延伸因子EF - 2和天冬酰胺酶) (图2b )。延伸因子EF-2对蛋白质合成至关重要，天冬酰胺酶是催化天冬酰胺水解为天冬氨酸的酶(表S5 )。在15和26 DAA的AL和SA中鉴定出氨甲酰磷酸合酶大链，参与氨基酸降解。在26 DAA，鉴定出两种胱硫醚γ -裂解酶亚型，特别是在AL中，与灌浆过程中的半胱氨酸释放有关。
图2. 小麦胚乳不同细胞类型蛋白质组的调控。( a ) 15和26 DAA不同细胞类型蛋白质谱的主成分分析( PCA )。三个独立的生物学重复用于蛋白质组学分析。( b ) Venn图表示了发育中的籽粒( 15和26 DAA)不同细胞类型的完整蛋白质组鉴定。( c )小麦籽粒灌浆15 - 26 DAA期间不同细胞类型中差异表达蛋白( DEPs )的热图。AL、糊粉；DAA，开花后天数；ETCs，胚乳传递细胞；SA，sub -糊粉；SE，淀粉胚乳。
3. 灌浆期胚乳不同细胞类型的差异表达蛋白( DEPs )
以log2 ( fold change ) = 1.5且P - value < 0.05为条件，识别蛋白丰度的显著变化，并将其归类为差异表达蛋白( DEP )。通过比较(15 DAA和26 DAA)发育阶段的每种细胞类型，即AL 15 DAA vs AL 26 DAA，SA 15 DAA vs SA 26 DAA，SE 15 DAA vs SE 26 DAA，以及ETCs 15 DAA和ETCs 26 DAA，确定了这些DEPs (表S6 )。15 DAA vs AL 26 DAA中，在AL共鉴定出67个DEPs，在SA中31个DEPs，在SE中27个DEPs，在ETC中50个DEPs。本分析旨在确定具体功能类别在籽粒灌浆过程中的总体富集趋势，如图2c所示。根据MapMan植物功能本体对DEPs进行分类。在15和26 DAA 期间(图2c，表S6)的细胞类型之间的比较中，共鉴定出156个独特的DEPs。有趣的是，与15 DAA相比，参与糖酵解的DEPs在26 DAA的SE中高度丰富，表明碳水化合物代谢在灌浆后期的SE中相对活跃(图2c )。糖酵解也参与氨基酸的生物合成，因为它将葡萄糖- 1 -磷酸( Glc-1- P)转化为一系列代谢物，这些代谢物可以有效地用于谷物胚乳中淀粉和蛋白质的储存。
4. 灌浆前期和后期不同细胞类型胚乳蛋白质组的功能注释
根据Ghatak和Ramsak对鉴定到的蛋白质进行功能分类。通过对功能类别 (图S1 ;表S7)的NSAF总得分求和，采用热图双聚类的方法描绘了不同胚乳细胞类型( AL、SA、SE和ETCs)在灌浆前中期( 15 DAA )和后期( 26 DAA )总蛋白质组的功能分布。比较不同时间点的所有胚乳细胞类型，参与氨基酸代谢的蛋白在26 DAA的SE中显示出增加的水平。
有趣的是，参与硝酸盐代谢的蛋白(如谷氨酸合成酶; GOGAT)在灌浆前中期( 15 DAA )首先在AL中大量积累，但在26 DAA时转变为在ETCs中，这表明在籽粒灌浆过程中发生了活跃的细胞类型转换(图S1 ;表S7)。在小麦籽粒发育过程中，NH+4主要通过谷氨酰胺合成酶( GS )、谷氨酸合成酶( GOGAT )和谷氨酸脱氢酶( GDH )的共同作用进行同化。在本研究中，GDH活性在15 DAA时较高，在26 DAA时迅速下降，即在储藏物质密集灌浆期间。这些观察结果可能表明GDH参与合成代谢过程，其最终产物为蛋白。
与蛋白质合成相关的蛋白质功能亚类在灌浆前中期( 15 DAA )和后期( 26 DAA )的外胚乳( AL和SA)中均表现出增强的调控作用。相反，参与翻译后修饰的蛋白在内胚乳( SE和ETCs ;图S1 ;表S7)中被高度调控。此外，参与糖、金属和氨基酸转运的蛋白在灌浆前中期( 15 DAA ) ETCs中表达量增加，在灌浆后期 ( 26DAA ;图S1 ;表S7) 转变为AL和SA。
对胚乳4种细胞类型，利用COVAIN工具箱对不同灌浆时期( 15 DAA和26 DAA)的蛋白质进行K均值聚类分析，揭示了籽粒发育过程中胚乳不同细胞类型蛋白质组的空间协调变化。K值因灌浆时期的不同而不同。15 DAA 的k为35个簇，26 DAA的k为15个簇(表S8 )。
在授粉后15 d，聚类12和25蛋白在AL中丰度较高，内胚乳细胞类型逐渐减少。*酮丙**酸磷酸双激酶( PPDK )有2种异构体，在淀粉合成和能量供应中发挥重要作用。在SE中，聚类5，16和22在15 DAA中显示出高水平的蛋白质(表S8 )。丝氨酸/苏氨酸激酶和液泡蛋白分选35和27在SE中显示出显著增加的水平。同样，在26 DAA (聚类4和聚类7)中，液泡蛋白分选35和27在SE和ETCs中显示出增加的水平(表S8 )。液泡蛋白分选相关蛋白(Vacuolar protein sorting-associated，Vps )是内吞体分选转运复合体( ESCRT )的一部分，在远离细胞质的情况下执行拓扑独特的膜弯曲和剪切反应。它们主要是运输膜相关酶所必需的。在聚类中结合的SA蛋白中，与15 DAA相比，13个SA蛋白在26 DAA中的表达量增加(表S8 )。蛋白转运SEC13 - like蛋白在SA中高丰度表达，参与蛋白从内质网到高尔基体的转运和核质转运。26 DAA蛋白质水平的增加表明SA中蛋白质合成活性较高。这就解释了为什么SA具有较高的蛋白浓度，并且在灌浆后期SA和SE之间的差异较小。在ETCs中，聚类8和26显示了蛋白质的增强调控，如15 DAA中胚胎发育晚期丰富蛋白D - 34。囊泡相关膜蛋白相关的三种异构体被鉴定出具有相似的模式。同样，聚类17、33和35也显示了ETCs中水平增加的蛋白质(表S8 )。这些结果表明，在15 DAA时，ETCs中的氨基酸生物合成和蛋白质修饰高度活跃，这与ETCs是胚乳中同化物运输的上游的假设一致。
为了揭示灌浆过程中胚乳不同细胞类型(AL、SA、SE和ETCs)的蛋白质积累规律，以15 DAA时获得的样品的蛋白质表达量为参考。使用26 DAA与15 DAA的相对蛋白表达比(26 DAA/15 DAA)来确定每种细胞类型中蛋白质的丰度(图S2;表S9)。
5. 小麦胚乳发育过程中的动态代谢组变化
利用GC-TOF-MS对发育中的胚乳( 15和26 DAA)的4种不同细胞类型( AL、SA、SE、ETCs)进行了代谢组分析，共鉴定出41个经内标和鲜重归一化的代谢物。将鉴定到的代谢组分类为碳水化合物、氨基酸和有机酸(图3 ;表S10)。胚乳发育与碳水化合物代谢密切相关。在本研究中，与26 DAA相比，大部分已鉴定的碳水化合物(如蔗糖、葡萄糖、果糖和肌醇)在15 DAA期间在SE和ETCs中高度积累(图3 )。蔗糖在谷物发育过程中对碳氮平衡的调控具有重要作用，也可用于合成淀粉。葡萄糖和果糖都是光合作用的产物，在花后15 d积累量较高。肌醇负责寡糖合成、磷酸盐储存和激素运输。类似地，参与碳水化合物相互转化的酶(如GLA、BF、BFF、SUSy)在15 DAA内胚乳( SE和ETCs)中表现出更高的积累(图3 )，这与我们的蛋白质组学分析结果一致。15 DAA时胚乳内部碳水化合物的积累表明能量和碳储存是胚乳发育早期和中期的活跃过程。
糖酵解、TCA循环和线粒体电子传递链对许多细胞功能提供能量至关重要。我们鉴定了几种有机酸，包括富马酸、柠檬酸和苹果酸，它们都在TCA循环中起着重要作用。与15 DAA相比，这些有机酸在26 DAA时在AL中的积累明显更高，表明在AL发育后期TCA循环非常活跃，以提供能量(图3 )。籽粒灌浆过程中积累了多种氨基酸。在本研究中，氨基酸积累表现出一种特殊的模式，在胚乳不同细胞类型的两个发育时间点( 15和26 DAA)之间发生显著变化。例如，天冬酰胺在15 DAA的SE和ETCs以及26 DAA的AL中表现出显著的积累。天冬酰胺用于氮的储存和运输。
同样，在蛋白质组水平上，发现15 DAA期间AL中具有更高的硝酸盐代谢调控。在籽粒灌浆过程中，AL细胞将同化物转运到胚乳中。ETCs的主要功能是代谢物的吸收，如糖类和氨基酸，用于籽粒灌浆。因此，可以得出结论，与26 DAA相比，15 DAA期间N-再利用更为活跃。
有趣的是，在15 DAA时，脯氨酸在内胚乳的积累显著高于外胚乳( AL和SA ;图3)。脯氨酸是一种渗透调节物质和自由基清除剂，可以保护细胞免受各种非生物胁迫，这对于细胞主动分裂以维持持续生长非常重要。同样，在脯氨酸合成中起重要作用的蛋白吡咯啉-5-羧酸还原酶(PyrCR)在15 DAA期间的所有胚乳细胞类型中的调节均高于26 DAA。
讨论
小麦是全球产量第二大谷物，是粮食、饲料和许多工业用途的重要来源。因此，了解籽粒发育的分子机制对培育优质小麦和实现全球粮食安全具有重要意义。在前期研究中，我们分析了小麦籽粒在12、15、20和26 DAA四个连续发育阶段，种皮、胚、胚乳和囊液四个不同组分中蛋白质和代谢物水平的动态变化。胚乳发育是一个高度复杂的过程，受籽粒灌浆机制控制。最终，胚乳成分决定了种子的萌发效率和营养品质。在本研究中，利用LMD方法研究了胚乳的不同细胞类型(AL, SA, SE, ETCs)，揭示了两个重要过渡时间点(15和26 DAA)的蛋白质和代谢物的时空分布。迄今为止，这是首次使用多组学方法研究不同细胞类型的小麦胚乳的研究。
生理上，小麦籽粒含水量、鲜重和干重从12 DAA到26 DAA逐渐增加。10 DAA后，籽粒完成细胞化和分化过程，以细胞的生长和伸长为主。因此，15和26 DAA被认为是小麦籽粒发育过程中快速积累阶段的开始和结束，在这个阶段细胞含量完全改变。在本研究中，可溶性糖、蔗糖和淀粉含量等同化物在籽粒灌浆过程中表现出动态调节，表明蔗糖代谢的重要作用及其与淀粉积累速率的关系(图1e , f)。
1.小麦胚乳发育过程中的糖装载
小麦籽粒中淀粉的生物合成是一个复杂的过程，包括胚乳细胞壁的裂解、淀粉的水解和光合产物(糖和氨基酸)的运输。蔗糖是一种重要的光合同化物，来源于源叶的光合作用。在本研究中，基于不同细胞类型的蛋白质组学和代谢组学分析，提出了小麦籽粒( 15和26 DAA ;图4)中有效糖装载的细胞途径模型。在形态上，蔗糖在小麦中的运输是通过维管束启动的。蔗糖向内运输并在胚乳腔中卸载。靠近胚乳的珠心突起( Nucleellar Projection，NP )细胞通过增加细胞表面(图4f)，促进细胞壁向内生长，以利于糖的装载。
在15 DAA期间，两个转运蛋白(蔗糖转运蛋白( SUT ))和葡萄糖转运蛋白( GLUT 12 )将蔗糖从胚乳腔液中进一步导入胚乳传递细胞( ETCs )。在代谢组水平上，与26 DAA相比，15 DAA内胚乳(SE和ETCs)中蔗糖的积累增加(图3和图4)。从ETCs中，蔗糖在4种 SUT和GLUT转运蛋白的帮助下被装载到SE中，随后蔗糖被蔗糖转化酶( BF和BBF)降解为葡萄糖和果糖，作为淀粉生物合成的第一步。另外，蔗糖通过蔗糖合酶(SS)降解为果糖和UDP -葡萄糖。在灌浆过程中，葡萄糖和果糖的积累模式与蔗糖在SE中的空间分布相似(图3和图4)。与26 DAA相比，SUT和GLUT转运蛋白的快速诱导与15 DAA期间蔗糖和SS活性的增加有关，这发生在胚乳淀粉积累开始之前。这也与灌浆早期/中期蔗糖的同化密切相关(图1c,d)。TaSUT1转运体在小麦灌浆中期高表达，表现出更高的千粒重、粒宽和粒长，籽粒产量提高28%。因此，蔗糖转运对籽粒发育前中期极为重要。然而，转运蛋白的调控在不同细胞类型和发育阶段( 15和26 DAA)之间存在差异，这对于籽粒灌浆过程中正确的蔗糖分配至关重要(图4 )。
图3. 15DDA和26 DAA时期不同胚乳细胞类型中代谢组的调控。( a ) 15和26 DAA时期不同细胞类型中鉴定的代谢物分类。( b )条形图表示所选碳水化合物的积累模式。( c )条形图代表了所选有机酸的积累模式。( d )条形图表示所选氨基酸的积累模式。误差棒表示来自三个生物学重复的标准误差( * P值< 0.05)。AL，糊粉；DAA，开花后天数；ETCs，胚乳传递细胞；SA,亚糊粉；SE，淀粉胚乳。
图4. 小麦籽粒发育过程中糖装载细胞途径的概念模型。代谢物和转运体用黑色字母书写。蛋白质用红色字母书写。转运蛋白和酶的水平经归一化处理后取3次生物学重复的平均值。两行正方形表示15和26 DAA。蛋白质有两个列表示SE和ETCs中的值，而转运蛋白有三个列表示SE、ETCs和CF ( CF :腔体流体数据,取自Zhang et al , 2021)。蛋白质水平从最低到最高的值从蓝色到红色，转运体水平从绿色到黄色。代谢物水平从低到高依次为橙色、黄色。AGPase，ADP -葡萄糖焦磷酸化酶；BAM，β -淀粉酶；BF，β -呋喃果糖苷酶不溶性同工酶2；Bff，1 2-Beta-果聚糖1F -果糖基转移酶；CF，空腔流体；EC，胚乳腔；ETCs，胚乳传递细胞；GBDE，糖原脱支酶；GBE2，(1 ,4 - α -葡聚糖分支酶Ⅱ；GBSS，颗粒结合型淀粉合成酶；GLUT，葡萄糖转运体；HXK，己糖激酶；NP，珠心突起；PGI，磷酸葡糖异构酶；PGM，磷酸葡萄糖变位酶；RA，氧化还原活化；SE，淀粉胚乳；SS，淀粉合成酶；SUSy，蔗糖合成酶；SUT，蔗糖转运蛋白；TPS，海藻糖合成酶；VB，维管束。
2.小麦胚乳发育过程中的淀粉代谢
我们鉴定了淀粉生物合成途径中的所有关键酶，包括ADP -葡萄糖焦磷酸化酶( AGPases )，两种可溶性淀粉合成酶(SS)，糖原合成酶( GYS )和颗粒结合淀粉合成酶(GBSSs )。这些酶的活性强烈影响小麦的粒重(图4 )。与灌浆后期( 26 DAA )相比，所有关键调控因子在灌浆前中期( 15 DAA )的调控作用均增强。SS和GYS的两个异构体在15 DAA期间显示出增加的调控，这可能有助于在灌浆早期直链淀粉和支链淀粉积累到淀粉颗粒中(图4 )。在鉴定的淀粉生物合成蛋白中，5种β-淀粉酶(BAM)亚型在所有细胞类型( AL、SA、SE、ETCs)中均被鉴定，与15 DAA相比，在26 DAA期间SA和SE中的表达上调。β-淀粉酶是一种淀粉降解酶，可以水解α -1，4-D-糖苷键，从谷物发育过程中合成的各种多聚葡聚糖的非还原末端释放β -麦芽糖。它是淀粉胚乳( SE )中的主要蛋白质之一。同样，在代谢组水平上，我们发现15 DAA时SE中麦芽糖的积累比26 DAA时显著增加。麦芽糖是β -淀粉酶降解线性葡聚糖的主要产物。麦芽糖积累可导致( 15 DAA ;图4)籽粒在发育早期和中期具有较高的渗透势，吸收过量的水分，使种皮和果皮伸展。籽粒成熟过程中失水导致籽粒成熟时皱缩，这可能与( 26 DAA)灌浆后期麦芽糖积累较少有关。已有研究表明，β-淀粉酶基因在大麦籽粒发育过程中转录和翻译，在SA和AL中存在一定的富集。大部分的β -淀粉酶在种子萌发前形成。此外，有研究报道，在胚萌发过程中，AL组织中产生除β -淀粉酶外的淀粉水解酶(如α -淀粉酶)，然后释放到SE中。在种子萌发过程中，蛋白水解机制激活SE中预先存在的β -淀粉酶分子。Nadaud等认为小麦AL中高丰度的β -淀粉酶可能与活细胞的能量供应有关。此外，淀粉也可以在AL细胞中暂时积累，在籽粒灌浆过程中被降解，并被贮藏蛋白和脂质所取代。因此，AL中β -淀粉酶蛋白丰度的增加是合理的。所有讨论的蛋白质和代谢物可以在表S10和S11中鉴定。
3.小麦籽粒灌浆过程中糊粉层( AL )和胚乳传递细胞( ETCs ) (修饰糊粉层)之间蛋白质水平的变化
光同化物从胚乳腔进入发育中的胚乳后，AL和ETCs可能是调节淀粉和蛋白质空间分布的两个调控过程。考察了AL与ETCs的相互作用(表1 )。2个贮藏蛋白( 11S球蛋白种子贮藏蛋白和SSA1 - 2S清蛋白种子贮藏家族蛋白前体)和蛋白转位酶亚基Sec A在籽粒灌浆过程中表现出AL水平升高(change 1)，表明AL在蛋白质贮藏中发挥重要作用。在15和26 DAA期间ETCs中高丰度的蛋白质( change 2 )与转运蛋白(如镁离子转运蛋白MRS2-1和蛋白质转运蛋白sec31)和酶(如过氧化氢酶、硝酸还原酶和过氧化物酶17 ;表1)有关。这表明分子运输和生物过程是ETCs在籽粒灌浆过程中的关键任务。
镁(Mg2+)是所有活细胞所必需的大量元素。它作为Chl分子的中心金属离子。它有助于膜的稳定性、离子转运调节、阳离子平衡以及参与各种生理过程的许多酶的激活。作为镁离子内流的中介体，镁离子转运体MRS2 -1在ETCs中被鉴定，并在籽粒灌浆过程中保持稳定的水平，表明ETCs是籽粒灌浆过程中所必需的Mg2+的入口点。Change 3包括谷丙转氨酶2、抗病反应、谷氧还蛋白C4和豌豆球蛋白等在籽粒灌浆过程中AL和ETCs中丰度较高的蛋白(表1 )，表明胁迫和氧化还原可能是AL和ETCs共同的功能联系。
类氨基转移酶蛋白为3-1，表明在籽粒灌浆过程中，活跃的中心氨基酸代谢由ETCs向AL转变。只有1-2个蛋白为1-2、2-3和3-1，9个蛋白为3-2，说明在15 DAA中，AL和ETCs活性较高，而在26 DAA中，ETCs活性相对较高。钾转运体表现出3-2的变化。参与囊泡运输的蛋白和液泡分选的蛋白也发生了变化(表1 )。
粒型液泡加工酶归因于蛋白贮藏液泡中贮藏蛋白的成。在ETCs中发现天冬酰胺内肽酶/液泡加工酶，表明ETCs是蛋白质加工的关键胚乳细胞类型(表1 )。11S球蛋白种子贮藏蛋白(fragment)从ETCs到AL呈梯度增加，在籽粒灌浆过程中加强。虽然ETCs是蛋白质加工的活性位点，但AL可能表现出更高的库容量(表1 )。
表1 AL和ETC中不同的蛋白分布模式
( a )示意图描述了蛋白质的变化。蓝色条带表示AL；粉红色条带表示ETCs。其中，变化1表示AL中含量丰富的蛋白质，变化2表示ETCs中含量丰富的蛋白质，变化3表示AL和ETCs中含量丰富的蛋白质。箭头表示籽粒灌浆过程中的变化，箭头旁边的数字表示变化类型( e.g.1在灌浆过程中变为2 ,记为1-2)。括号中的数字表示参与不同变化类型的蛋白质的数量。(b)在表中，(+)表示高丰度，(-)表示低或0水平的蛋白质。缩写：AL，糊粉层；ETCs，胚乳传递细胞。
4. 小麦胚乳发育过程中蛋白质的积累模式
4.1糊粉层( AL )在胚乳发育过程中的主要变化与碳水化合物代谢、氧化应激和信号蛋白有关
通过细胞化过程，内部细胞变成淀粉胚乳。相反，外围细胞变成糊粉层，在14 DAA时达到成熟形态，并通过构建高代谢活性在整个籽粒发育过程中保持相当活跃。在这里，我们选取了15 DAA进行分析，以表征籽粒灌浆过程中的这种特定代谢活动。AL中的蛋白质和矿物质积累发生在11-27 DAA之间。
碳水化合物代谢是籽粒发育的基础；它是主要的能源。在本研究中，在15和26 DAA的6个蛋白中，有5个蛋白在AL中下调，参与糖酵解途径。大多数与C3循环/糖异生相关的蛋白在15和26 DAA的AL中也表现出下调趋势，而与糖代谢相关的蛋白则表现出相反的趋势(表S9 )。在AL发育过程中，葡萄糖- 6 -磷酸异构酶和己糖激酶6的两种异构体的上调表达表明它们在通过积累具有渗透保护活性的糖(图S2)实现脱水耐受中的重要作用。它们是糖代谢中的关键酶。有趣的是，在小麦籽粒发育早期中也观察到类似的碳水化合物代谢调控。AL是富含微量营养素、维生素、抗氧化剂和必需氨基酸等代谢物的外周谷物组织。因此，进一步证实了AL是代谢过程的上游，并在胚乳中同化运输途径的假设。
氧化应激蛋白( oxidative stress proteins，OS )在籽粒灌浆过程中具有重要作用；它们促进氨基酸的产生并控制ROS的活性，从而使球蛋白在AL中积累和成熟。氧化应激( Oxidative stress，OS )和防御蛋白保护AL在籽粒发育过程中的积累。这些结果与我们的观察结果一致，我们在灌浆期( 15和26 DAA ;表S9)中观察到AL中氧化应激蛋白(如谷胱甘肽转移酶、水通道蛋白、延伸因子β-1等)增加。同样，信号蛋白的调控也仅在AL中显著(表S9 )。14-3-3蛋白在细胞信号转导、细胞周期调控、氮和碳同化等多种细胞生理过程中发挥调控作用。Nadaud等观察到4个14-3-3蛋白在整个AL发育过程中同样丰富，因为信号和信号转导在籽粒发育的早期阶段最大，而在中期阶段减少。14-3-3的减少与淀粉合成和积累呈负相关。然而，在本研究中，在SA和SE中，14-3-3蛋白的调控没有显著变化(图S2 )。
4.2在胚乳发育过程中，胁迫/防御蛋白在淀粉胚乳( SE )中被激活
应激/防御蛋白在贮藏积累阶段发挥着重要的保护作用。Nadaud等报道，在籽粒发育的三个主要阶段中，中期阶段的特征是氧化应激和防御蛋白( 65 % )，这可以与籽粒发育过程中外围层的水分损失联系起来。有趣的是，在胁迫/防御蛋白中鉴定到serpin (丝氨酸蛋白酶*制剂抑**)蛋白，与15 DAA相比，在26 DAA的所有细胞类型中都具有显著高丰度(表S9 )。Serpin蛋白在种子成熟过程中高表达，并在发育过程中保护细胞免受氧化应激。此外，还发现小麦Serpin可能对位于淀粉体周围的醇溶蛋白起保护作用。它们可能在胚乳发育过程中保护SE组织中的淀粉(图S2 )。这些蛋白对脱水籽粒的细胞内容物也有保护作用。之前，已经报道了在12 - 26 DAA 时期，除胚外，serpin蛋白的调控在小麦籽粒(即种皮、腔液和胚乳)的所有组织中都有所增加。此外，在15和26 DAA (图S2 ,表S9)时期，还鉴定到其他几个蛋白在不同细胞类型中具有显著不同的积累模式。
4.3小麦胚乳发育过程中的细胞程序性死亡( PCD )
鉴于活跃的基因表达和功能细胞器对于淀粉生物合成和贮藏蛋白积累都是必需的，Liu等提出了淀粉胚乳细胞中高度特化的PCD形式，其中只有细胞质膜失去完整性，而大多数细胞内细胞器，如细胞核、线粒体、质体、内质网( ER )和高尔基体仍然保持功能和完整性。这在共享的细胞质中形成了一个大的隔室，使糖和氨基酸自由循环，并使有效的淀粉生物合成和储存蛋白积累。在胚乳的发育过程中可以观察到细胞死亡的梯度，表现出物种特异性的模式。在玉米胚乳中，细胞死亡从冠部向基部移动。在大麦种子中，PCD从中心区域到外围区域呈梯度方式发生。相反，在小麦胚乳中，淀粉胚乳的PCD也开始于16 DAA，并持续到30 DAA；细胞死亡的发生是随机的，缺乏明显的波浪状模式。在本研究中，PCD涉及乙醇酸氧化酶，在所有胚乳细胞类型中都被鉴定。丰度在胚乳细胞类型和不同灌浆时期之间总体保持稳定，在26 DAA时SE和ETCs的丰度相对较高(表S7 )。此外，在籽粒灌浆过程中，脱落酸受体PYL2在不同类型胚乳细胞中的丰度没有明显的变化(表S7 )。活性氧( reactive oxygen species，ROS )包括过氧化氢( hydrogen peroxide，H2O2 )、超氧阴离子( superoxide anion，O2- )、羟基自由基( hydroxyl radical，·OH )和单线态氧( singlet oxygen，O2 )，是植物PCD发生、发展和调控的重要代谢副产物。植物通过部署抗氧化酶系统(包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶)以及抗氧化化合物(如谷胱甘肽)来抵御活性氧( ROS )的有害影响。这些成分共同中和并有效消除ROS诱导的细胞损伤。超氧化物歧化酶在26 DAA的SA中被鉴定(表S7 )，而过氧化氢酶在灌浆过程中的所有胚乳细胞类型中都被发现，在ETCs (表1和表S7)中含量显著较高。过氧化物酶在26 DAA的SA和SE中含量较高，而过氧化物酶17在ETCs中含量较高，过氧化物酶65在26 DAA的(表1 ;表S7)中含量较高。其他参与ROS和胁迫系统的酶如图5所示。
图5：15和26 DAA期间不同胚乳细胞层中蛋白质和代谢物动态的生物化学途径图。代谢物用黑色字母书写；蛋白质用红色字母书写。蛋白和代谢物水平经归一化处理后取3个重复的平均值。从左到右四个连续的正方形表示胚乳在15和26 DAA的四种细胞类型 (糊粉; ETCs , 胚乳转移细胞; SA , 亚糊粉层; SE ,淀粉胚乳)。代谢物水平从最小值到最大值的颜色从绿色到黄色，蛋白质水平从最小值到最大值的颜色从蓝色到红色。ACC，乙酰辅酶A羧化酶；ACLY，ATP柠檬酸裂解酶；ACSS，脂酰CoA合成酶；AGPase，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；ALAT，丙氨酸氨基转移酶；APX，抗坏血酸过氧化物酶；AspAT，天谷草转氨酶；BAM，β -淀粉酶；BF，β-D-呋喃果糖苷酶不溶性同工酶2 (细胞壁转化酶)；BFF，1 2-Beta-果聚糖1F -果糖基转移酶(液泡转化酶, VINV)；CPI，半胱氨酸蛋白酶*制剂抑**；CS，柠檬酸合成酶；ECH，烯酰辅酶A水合酶；FH，延胡索酸水合酶；GBDE，糖原脱支酶；GBE，1，4 - α葡聚糖分支酶；GBE2，1，4 - α -葡聚糖分支酶Ⅱ；GBSS，颗粒结合型淀粉合成酶；GDH，谷氨酸脱氢酶；GOGAT，谷氨酸合成酶；GPR，γ -谷氨酰磷酸还原酶；GST，谷胱甘肽S 转移酶；HK，己糖激酶；HSD，天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶；ICL，异柠檬酸裂解酶；IDH，异柠檬酸脱氢酶；IMDH，3 -异丙基苹果酸脱氢酶；IMS，2-异丙基苹果酸合酶1；KTI，Kunitz型胰蛋白酶*制剂抑**；MCAT，丙二酰单酰辅酶A转酰基酶；MDH，苹果酸脱氢酶；MTOX，N -甲基- L -色氨酸氧化酶；OGDH，2 -酮戊二酸脱氢酶；PDH，*酮丙**酸脱氢酶E1；PFK，磷酸果糖激酶家族蛋白；PFP，果糖- 6 -磷酸1 -磷酸转移酶；PGI，磷酸葡糖异构酶；PK，*酮丙**酸激酶；PRP，病程相关蛋白4B ( Fragment )；PSAT，磷酸丝氨酸氨基转移酶；PyrCR，吡咯啉-5-羧酸还原酶；SAM，S -腺苷甲硫氨酸合成酶；SDH，琥珀酸脱氢酶；SIP，应激蛋白；SS2，淀粉合成酶2；SS3，可溶性淀粉合成酶3；SUSy，蔗糖合成酶；THDH，苏氨酸脱水酶生物合成；TPS，海藻糖合成酶；Trp B，色氨酸合成酶β链1；TS，苏氨酸合成酶；USP，通用应激蛋白。
4.4发育中胚乳不同细胞类型的蛋白质组和代谢组景观
为了更好地理解小麦胚乳( AL、SA、SE和ETCs)不同细胞类型中的生化机制，以及相关的代谢组和蛋白质组变化，提出了可能的代谢途径(图5 )。参与不同细胞类型不同调控的主要通路有碳水化合物代谢( TCA循环、糖酵解、淀粉合成)、储存蛋白、氨基酸代谢、脂质代谢、应激/防御蛋白和氧化应激/氧化还原。总体而言，从15 DAA到26 DAA，TCA /糖异生和氨基酸代谢表现出逐渐降低的趋势，表明在籽粒发育后期，小麦胚乳不同细胞类型中的初级代谢减少或转变为ATP消耗较少的代谢途径。蔗糖和氨基酸等分子首先在早期/中期合成，在胚乳发育过程中用于淀粉和贮藏蛋白的合成(图5 )。胚乳发育过程中的其他重要代谢过程包括胁迫防御和氧化应激蛋白/氧化还原，以保证发育后期胚乳的正常发育。
萌发种子的能量需求似乎主要通过糖酵解来满足。在本研究中，参与糖酵解的关键蛋白，包括果糖- 6 -磷酸- 1 -磷酸转移酶( PFP )，磷酸果糖激酶家族蛋白( PFK )和*酮丙**酸激酶( PK )，在15和26 DAA期间在ETCs中显示出增加的水平。在代谢组水平上，糖酵解相关代谢物(葡萄糖- 6 -磷酸、果糖- 6 -磷酸和甘油- 3 -磷酸)在ETCs中的调控作用弱于SE。相反，*酮丙**酸水平(糖酵解产物)在ETCs中显示出增加的水平(图5 )。这些结果表明，ETCs在向发育中的胚乳提供能量( ATP )方面具有重要作用。
天谷草转氨酶 ( AspAT )和丙氨酸氨基转移酶( ALAT )是代谢中间产物的必需酶。它们是蛋白质合成的重要底物，与三羧酸循环和氨基酸代谢直接相关。天冬氨酸和丙氨酸也可能作为氨基基团供体的作用补充谷氨酸池。丙氨酸氨基转移酶( ALAT )在15和26 DAA期间在ETCs中上调。磷酸丝氨酸转氨酶( PSAT )是TCA和氨基酸代谢中的另一个重要酶。与15 DAA相比，PSAT在26 DAA时对SA和SE的调控增强，保证了灌浆过程中谷氨酸的供应。
与胁迫代谢相关的蛋白在26 DAA期间显著增加，尤其是AL和ETC中的普遍胁迫蛋白( USP )。植物USP蛋白参与多种非生物胁迫和生物病原的应答反应。然而，在种子发育过程中，它们可能调节其他生理过程，如激素调节。在本研究中，我们还鉴定了几种热激蛋白( HSPs )，包括小分子热激蛋白( sHSPs )，它们可能参与蛋白质的正确折叠，并在胁迫条件下充当分子伴侣以保护发育过程。
小麦成熟籽粒蛋白质含量和品质的空间分布已经确定。正如讨论所述，参与糖代谢的两个关键酶(葡萄糖- 6 -磷酸异构酶和己糖激酶6)在AL中上调(图S2 )，并在积累具有渗透保护活性的糖对抗脱水耐受中发挥重要作用。不同胚乳细胞类型中碳水化合物和贮藏蛋白的代谢错综复杂地相互作用、相互调节，最终使每种胚乳细胞类型表现出不同的功能和调控。推测在成熟小麦籽粒中的这种空间分布的形成过程，是基于籽粒灌浆过程中的两种运输途径。一个是从AL运输到内胚乳；另一种是通过胚乳腔周围的胚乳外壁向胚乳辐射(图5 )。在不同的籽粒灌浆阶段，哪条途径起主要作用尚不清楚。推测这两条途径随灌浆时期的不同而变化。然而，在目前的研究中，我们认为这两条途径的转换是由于不同同化物的积累以及蛋白质和代谢物(见"小麦胚乳发育过程中的糖负载和淀粉生物合成"和图4、5)的调控。胚乳中不同细胞类型的协同调控为小麦胚乳发育过程中蛋白质组和代谢组的动态相互作用提供了新的见解。所有讨论的蛋白质和代谢物可以在表S10和S11中鉴定。
结论
小麦胚乳由糊粉、亚糊粉、淀粉胚乳和胚乳转移细胞组成，每个细胞都有自己的时空生理和分子机制。所有这些不同的细胞类型以不同的速度发育。本研究共鉴定到1803个蛋白质和41个代谢物，结果表明这些蛋白质和代谢物在不同胚乳细胞类型发育过程中的积累模式不同。例如，AL展示了一个高度差异表达的蛋白质组和代谢组，分布在碳水化合物生物合成、氧化应激和信号传导之间。尽管先前的研究已经在小麦籽粒中鉴定了一些编码糖转运蛋白和参与糖卸载和分配的酶的单个基因，但缺乏对胚乳发育过程中控制蔗糖转运和利用的分子生物景观的整体理解，包括每种细胞类型的相互作用。例如，SUT和GLUT转运蛋白在籽粒灌浆前/中期的作用知之甚少，而后者启动了籽粒灌浆过程中的淀粉生物合成。同样，在本研究中，GOGAT、GDH和谷氨酸在发育过程中存在有趣的细胞类型特异性相互作用。GDH将NH4+转化为2 -酮戊二酸，形成谷氨酸或氧化谷氨酸。尽管15N-或13C-标记实验已经证明细胞内发生了脱氨反应，但已有研究认为，在一定生理条件下，当NH4+浓度达到一定阈值时，GDH参与NH4+同化。因此，研究GS、GOGAT和GDH在NH4+含量较高的籽粒中不同细胞类型发育胚乳中的作用将很有意义。
同样，硝酸盐代谢、硝酸盐转运、ABC转运蛋白和多药耐药系统在灌浆前/中期( 15 DAA )的外胚乳( AL和SA)和发育后期( 26 DAA )的内胚乳( ETCs )中表现出增加的调控。此外，我们的代谢组方法鉴定了胚乳发育过程中代谢物水平的动态变化和不同细胞类型之间的相关性。本研究为未来分析了解籽粒发育过程中蛋白质和代谢物的空间分布提供了框架，可以根据育种目标进行改进。