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在致盲性疾病或创伤的情况下，水凝胶被建议用作角膜再生的支架和眼部给药的载体。在资源有限的地区，恢复角膜透明度、增厚薄角膜和术后给药尤其具有挑战性，因为在这些地区药物供应和患者依从性可能都不尽如人意。
因此，来自 瑞典林雪平大学的Neil Lagali 报道了一种基于猪皮肤胶原蛋白作为人类供体角膜组织的替代品的生物工程水凝胶，用于需要水凝胶长期稳定性的应用 。水凝胶是用从海洋无脊椎动物中提取的纤维素纳米纤维（CNF）增强的，然后进行双化学和光化学交联。水凝胶还含有地塞米松，以提供持续的抗炎活性。相关论文“A double-crosslinked nanocellulose-reinforced dexamethasone-loaded collagen hydrogel for corneal application and sustained anti-inflammatory activity”于2023年10月20日发表于杂志《Acta Biomaterialia》上。
- 与未增强的水凝胶相比，负载药物后增强的双交联水凝胶保持了高的光学透明度，显著改善了机械特性，同时支持药物在体外逐渐持续释放60天。
- 地塞米松在水凝胶生产中经过交联和灭菌处理后，抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激的血管内皮细胞的管状形成和细胞迁移，抑制TNF-α刺激的人角膜上皮细胞中关键的促炎细胞因子CCL2和CXCL5。
- 12只新西兰大白兔接受炎症缝线刺激的角膜基质内植入8周后，地塞米松释放水凝胶抑制TNF-α、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）以及白细胞和成纤维细胞的侵袭，从而减少角膜混浊、持续的角膜厚度和基质形态，并减少整体血管侵袭，这种胶原-纳米纤维双交联凝胶可用于治疗角膜移植后的角膜基质疾病，同时抑制炎症，保持透明。
图1 飞秒激光辅助水凝胶植入示意图
1. BPCDX-CNF和BPCDX-CNF- Dex水凝胶的生物降解性和物理特性
地塞米松负载和对照水凝胶的光学和力学性能如图2所示。与人类角膜相比，Dex材料仍然保持着更高的透明度，透过率超过85%(图2A)，并且在白色背景和高对比度物体上观察时，不会呈现任何偏色域或可感知的光散射(图2B)。与之前报道的双交联生物工程猪构建体（BPCDX）性能相比，用CNF增强BPCDX的力学性能得到了改善(图2C-F)。各组之间的溶胀比（BPCDX-CNF 与 BPCDX-CNF-Dex 分别为 709 ± 70.3 与 834.3 ± 153）也无显著差异（图 2H）。胶原酶对 BPCDX-CNF 和 BPCDXCNF-Dex 水凝胶的酶降解速度比人类角膜快得多，但两者之间没有明显差异（图 2I）。扫描电镜分析表明，水凝胶呈现多孔结构，细纤维网高度交织，多孔区域随机分布在纤维之间（图 2K）。
图2 水凝胶材料性质
2. 药物随时间的释放
为了评价地塞米松水凝胶的药物释放动力学，测量了地塞米松在BPCDX-CNF-Dex水凝胶中的累积释放量。释药量符合5参数Logistic-Richards曲线模型，其渐近线约为49.2 μg(图2J)。首次释药6h约为8.2 μg(占总量的16.2%)，前24 h约为10.3μg(20.4%)，第9天达到最大释药量的一半(50%)，在相对快速释药阶段(前10天)，累积释药量进一步增加至约31.3 μg，已有61.8%的药物释放。缓慢、逐渐的释放持续到第60天的实验终点。
3. 地塞米松诱导的人脐静脉内皮细胞迁移、管状形成及致炎细胞因子表达
HUVECs被用来模拟在刺激和地塞米松治疗下在角膜中形成新血管的血管内皮细胞。血管内皮细胞对角膜中的细胞因子梯度很敏感，在炎症环境中可以迅速转变为增殖和迁移表型。在细胞迁移实验中，用地塞米松处理TNF-α刺激的人脐静脉内皮细胞，细胞迁移受到抑制，而在未处理的对照组，刺激的人脐静脉内皮细胞在20小时内迁移到缝隙中，使缝隙不再可见(图3A，B)。地塞米松可抑制TNF-α刺激人脐静脉内皮细胞24 h后的管状形成。观察到不规则的线状结构，但没有典型的管状结构。相反，对照组HUVEC在同一时间点形成毛细血管样小管结构(图3C)。受刺激细胞的蛋白质和基因表达表明，与受刺激但未处理的细胞相比，地塞米松处理抑制了CCL2和CXCL5促炎趋化因子(图3E，F)。为了证实地塞米松在紫外光照射下不会影响其生物活性，在HUVECs中对已知受地塞米松影响的靶点进行了定量聚合酶链式反应(QPCR)测量。对于所有测试的目标，没有观察到关于药物的紫外线照射状态的差异，两种治疗方法都显著上调了TIMP1、MMP9和VEGFA(图3G-J)。
图3 15μg/mL地塞米松对TNFα刺激的人脐静脉内皮细胞的影响
4. BPCDX-CNF-Dex生物材料与原代人角膜上皮细胞的生物相容性
BPCDX-CNF- Dex和BPCDX-CNF样品均填充人角膜上皮细胞，并在体外培养16天。两种材料都支持活的和贴壁的上皮细胞(图4A)。TNFα刺激后，BPCDX-CNF- Dex培养的HCECs中CCL2和CXCL5的表达明显低于对照无负载BPCDX-CNF培养的HCECs(图4B)。
图4 水凝胶生物相容性
5. 兔角膜炎症模型的体内植入及评价
所有飞秒激光手术均无意外发生，生物材料通过飞秒激光切口成功植入角膜基质，无并发症。如图1所示，四根缝合线也成功地以与植入区外的植入物平行的圆周模式放置在眼内。
本研究中所有手术角膜的体内和离体图像如图5A所示。在手术角膜中，12例中有10例透明或仅轻微不透明，8周时植入角膜后的虹膜细节清晰可见。BPCDX-CNF对照组的角膜均有明显浑浊;然而，浊度的序数评分并没有显示组间的差异(图5B)。植入BPCDX-CNF-Dex的角膜血管总数较少，主要局限于角膜周边、缝线周围和植入区外(图5A，CE)。只有一个植入BPCDX-CNF-Dex的角膜有血管进入植入区，而BPCDXCNF组在8周时有4个角膜有血管进入(图5C)。然而，在8周时，治疗组和对照组之间的差异没有达到显著意义(图5C-E)。8周的眼压测量显示，植入BPCDX-CNF-Dex的眼的眼压(9.4±1.4 mm Hg)明显高于植入BPCDX-CNF的眼(5.4±0.8 mm Hg，图5F)。
图5 BPCDX-CNF植入术后角膜混浊、角膜新生血管及眼压变化
所有种植体均于术后即刻及术后8周进行AS-OCT检查。OCT观察到的周围组织的大体形态不受手术技术或种植体类型的影响，所有种植体在8周后仍保持在原位(图6A)。虽然大多数角膜在临床上是透明的，没有混浊(图5A)，但AS-OCT显示植入区域和周围基质(图6A)有适度的高反射率。两组术后直接角膜中央厚度均较术前显著增加，这与额外添加的材料有关(图6B, C)。
图6 术前、植入植体后及8周随访时中央角膜的前OCT
6. 角膜的体内和离体形态学检查
采用体内共聚焦显微镜(IVCM)观察术前和术后的角膜层。术前观察到平行的基底下神经，而前基质由规则分布的静止角化细胞组成，内皮清晰可见，由规则的六边形细胞组成(图7A)。采用飞秒激光基质内手术技术，两组手术后内皮保持完整(图7A)。在BPCDX-CNF-Dex组中，IVCM测定的内皮细胞密度与术前相比，术后没有任何可检测到的差异(图7B)。在6个植入BPCDX-CNF的角膜中，有4个角膜前部混浊遮盖了前部角膜基质细胞(图7A，C)。BPCDX-CNF-Dex组没有前部混浊，角膜细胞更容易看到，尽管反射率有一些增加，表明角膜细胞激活(图7A)。BPCDX-CNF组和BPCDX-CNF-Dex组术后8周神经分布均较术前减少。在BPCDX-CNF-Dex组中，6个角膜中有5个可检测到基底下神经，而BPCDX-CNF组中有3个可检测到基底下神经(图7D)。
图7 术前、术后8周兔角膜活体共聚焦显微镜观察
7. 房水中的炎症细胞因子和标志物
基于ELASA的前房细胞因子分析作为术后8周角膜持续炎症活性的间接测量(图8A)。与BPCDX-CNF- Dex组相比，BPCDX-CNF组TNFα浓度明显降低。NCAM-1(神经细胞粘附分子1)被认为是角膜内皮细胞健康状况的标志，在两组之间没有差异。然而，MMP-9在BPCDX-CNF-Dex组中也被抑制，证实了BPCDX-CNF组与BPCDX-CNF- Dex组中完整种植体降解的发现。
8. 移植角膜的组织学
H&E染色显示8周后植入物仍然存在，然而，在BPCDX-CNF组中，水凝胶材料部分降解，可见片段和大部分降解的植入物(图8B)。BPCDX-CNF-Dex组种植体边界完整，而BPCDX-CNF组种植体边界退化(图8C)。
图8 兔角膜植入物的生化指标、组织学和免疫组织化学检查
总之，作者 展示了一种由胶原蛋白组成和纳米纤维素纤维增强的透明水凝胶，并通过化学和光化学交联(BPCDX-CNF)增强 。BPCDX-CNF是一种可持续来源的天然生物材料，由猪真皮胶原蛋白组成，是食品工业的副产品，而CNF是通过可持续水产养殖生产的。这赋予了丰富、可再生和生物相容性的优势。
此外，BPCDX-CNF可以成功加载地塞米松，在植入后至少两个月内有效抑制炎症，这可能为克服术后对地塞米松滴眼液的需求提供了一种方法。因此，可以通过简化的手术程序和药物输送方法来保持角膜的透明度，这种方法适用于资源匮乏的地区，在这些地区需要替代人类供体角膜、标准侵入性手术和术后药物治疗。
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