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文|大菠萝

编辑|WEIXIAO

一、引言

角膜本质上是眼睛的窗户。

它是一种透明的无血管组织，由三个主要细胞层组成：最外层的复层鳞状上皮（约 50 lm 厚）、带角质细胞的间质（中央厚度约 500 lm）和最内层的特化内皮细胞单层（约 10 lm 厚） 。 使用供体组织进行移植是治疗不可逆性角膜失明的唯一广泛接受的治疗方法。

然而，优质供体组织的供应不能满足需求，自身免疫性疾病和化学烧伤等临床适应症可能不适合供体组织移植。

因此，迫切需要一种角膜替代物作为供体组织替代物。 在存在内皮衰竭或产生过量胶原酶或其他基质金属蛋白酶的临床条件下（例如碱烧伤和疱疹性角膜炎），需要调节基于胶原蛋白的角膜替代物的机械强度和生物降解性，以便合成记录支架退化和宿主组织再生的时间。

二、材料和方法

将 25 克 IG (0.096 mol) 溶解在含有 20 g 吡啶 (0.253 mol) 的 70 ml 氯仿中。将 15 毫升甲基丙烯酰氯 (0.156 摩尔) 滴加到上述溶液中，在氮气下用冰和水冷却 30 分钟。

将混合物在40℃下连续搅拌22小时。溶剂蒸发后得到淡黄色油状物。纯 MIG 在 20 C 冰箱中，从己烷中结晶后收集为淡黄色晶体。最后将产物在室温下真空干燥 24 小时。

合成甲基丙烯酰基‑aD‑吡喃半乳糖(MG)，将 15 克 MIG 溶解在含有 26 毫升三氟乙酸、6.5 毫升水和 0.15 克α‑丁基邻苯二酚的混合物中。将混合物在室温下搅拌3天后，通过真空蒸发除去溶剂。然后向残余物中加入25ml水，随后蒸发水。这个过程再重复两次。通过从乙醇（含有5%水）中结晶得到MG（10.38 g）（产率为92%）。

制备胶原蛋白‑pMG水凝胶，将460毫克10%猪胶原蛋白水溶液和 0.2 ml MES (0.625 M) 在混合系统中充分混合，在冰水浴中进行，然后依次进行注射溶解在 46升水中的 23 毫克 MG，11.5 mg PEGDA、2.40 mg EDC 和 1.44 mg NHS 溶解在 12 ll MES 中；和16 ll 的 1% Irgacure‑2959。

充分混合后，使用 2 N NaOH 将上述混合物的 pH 值调节至 5.5。最后，将所得均匀溶液浇注到透明聚丙烯隐形眼镜模具中或浇注在两片带有垫片的玻璃之间，并在光反应器中以 365 nm 的功率固化5.27 mW cm2 10 分钟，然后在 100% 湿度的室温下放置 16 小时。然后将模具转移到培养箱中，在 37°C 下再固化 5 小时。 最后用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗水凝胶 3 天。具有不同胶原蛋白与 MG 比例的水凝胶以相同的方式制备。

降解胶原酶中的水凝胶，将 50 至 80 mg 水凝胶在 5 ml 0.1 M Tris–HCl 缓冲液 (pH 7.4) 中于 37 C下平衡 1 小时，该缓冲液含有 5 mM CaCl2。随后，加入 1 mg/ml（288 U ml1 ）胶原酶溶液，使胶原酶最终浓度为 5 U ml1。每 8 小时更换一次溶液，以保留足够的胶原酶活性。

在不同的时间间隔，在轻轻吸干表面水后对水凝胶进行称重。每种水凝胶制剂测试了三个样品。平衡含水量，在 PBS 中平衡 3 天后，轻轻吸干水凝胶的表面水并记录水凝胶的湿重。然后将水凝胶真空干燥至恒重。

水含量（Wt）根据以下等式计算：Wt ¼ ½ðW W0Þ=W 100%；其中W0和 W 分别表示干燥和 PBS 平衡样品的重量。

微生物活力测定，在 0.9% Kirby–Bauer 盐水 (KBS) 中制备 0.5 McFarland 细菌悬浮液。一百微升的苏斯使用 30 号针头注射pension 的 101稀释液接种胶原蛋白水凝胶、胶原蛋白‑pMG 水凝胶（500 lm 厚、8 mm 直径）和人角膜（8 mm 直径）。

三、结果与讨论

如图1A所示，6.03 和 5.69 ppm 处的峰标记为甲基丙烯酸酯的乙烯基质子，而 1.87 ppm 处的峰标记为甲基丙烯酸酯的甲基质子。

在 FTIR 光谱中（图3B），1723 和 1639 cm1 处的吸收峰是甲基丙烯酸酯的mC@O和mC@C的特征。3493 cm1 处宽峰的消失表明半乳糖羟基上的氢原子被甲基丙烯酰基取代。所有这些结果表明 MIG 已成功合成。

在HNMR 谱图（图1B），保护基团异丙基峰在 1.41、1.36、1.29 和 1.27 ppm 处的完全消失，以及新羟基的出现（峰 11‑14）表明 MIG 中的保护基团已被去除完全感动了。

在13C NMR 光谱（图2）中，166.49、135.83 和 125.82 ppm 处的峰分别归因于甲基丙烯酸酯的 C@O、C@CH2和 C@CH2碳。 此外，92.66 ppm 处的强峰表明半乳糖部分的 α 异构体占主导地位。

FTIR 光谱进一步证实了去保护作用（图4），从 3400 和 3600 cm1 之间羟基的强吸光度的出现可以证明单晶 X 射线衍射显示 MG 采用正常的椅子构象，是一种a异构体（图4）。MG晶系单斜晶系，空间群为P2(1)。

a、b 和 c 的晶胞尺寸分别为 5.905(3)、7.930(4)、15.284(8) Å，其中 a = 90、b = 92.535 (7) 和c = 90，这与具有空间群 P2(1)2(1)2(1) 的正交aD‑半乳糖胶原蛋白‑pMG 复合水凝胶是通过 PEGDA 交联的 MG 在以下条件下同时光聚合制备的胶原蛋白与 EDC/ 的紫外线照射和化学交联NHS 在 pH 5.5 （图5）。

基于MG和胶原蛋白的聚合交联机制，交联的胶原蛋白网络和交联的pMG网络相互渗透，两者之间没有形成化学键两个网络。

据报道，明胶（变性胶原蛋白）和聚（1‑乙烯基‑2‑吡咯烷酮）网络之间通过类似机制形成了类似的 IPN 结构。

然而，先前报道的由胶原蛋白和聚（2‑羟乙基甲基丙烯酸酯）（pHEMA）形成的复合水凝胶仅具有半IPN结构，因为在这种复合材料中，只有pHEMA交联并形成水凝胶, 但胶原蛋白只是被困在 pHEMA 水凝胶内，胶原蛋白大分子之间没有化学键合（交联）。

由于 MG 中甲基丙烯酸酯的mC@O和峰的增强，胶原蛋白‑pMG 复合材料的FTIR 光谱（图6）中1717 cm1 处出现峰证明了 pMG 掺入胶原水凝胶网络由于胶原蛋白‑pMG 水凝胶中 MG 的mOAH ，在 3400–3600 cm1 。代表半乳糖六元环中 C9 的交叉极化/魔角旋转 (CP/MAS) 13C NMR 光谱（图7B）中 92.24 和 96.38 ppm 的峰的出现进一步表明a和b构象半乳糖共存于水凝胶的干燥状态。

从表1可以看出，随着 MG 与胶原蛋白比例的增加，水凝胶的白光透射率也增加并且优于人类角膜（图8）。

光传输的增加可能是由于 pMG 作为 GAG 模拟物发挥作用，它调节复合水凝胶中胶原纤维的形成，就像在人角膜中一样或由于 IPN 结构限制了复合水凝胶中胶原纤维的形成.水凝胶的光背散射值与人角膜 (3%) 相当。

所有水凝胶的折射率都在 1.35 左右，接近人类角膜的折射率 1.375–1.380。

从图9A 可以看出，在我们的实验范围内，随着 MG 与胶原蛋白的比例从 0.0625 (CG16) 增加到 0.25 (CG4)，复合水凝胶的拉伸强度明显增加。

当比例达到0.5（CG2）时，pMG显著增强了胶原复合水凝胶的拉伸强度（P < 0.05），尽管显着性很小。然而，当比例达到 1 (CG1) 时，拉伸强度下降，这可能是由于掺入过多的 pMG 导致刚性增加所致。

使用选定的水凝胶 (CG2) 进行的缝合测试表明，缝合点没有发生撕裂或微剪切（图10），这与我们之前从猪 I 型胶原蛋白和重组胶原蛋白中发现的类似水凝胶的结果相似 。

尽管在缝合试验中取得了成功，但由于与人体材料相比其机械强度较弱，因此这种材料可能不足以用于全层角膜移植。

如图11所示，纯胶原水凝胶降解非常快，在胶原酶溶液中孵育 8 小时后消失37 C，然而，随着 MG 含量的增加，胶原蛋白‑pMG 复合水凝胶变得更加稳定。

例如，CG1 在孵育 11 小时后仍保留其初始重量的 23%。随着 MG 含量的增加，复合水凝胶的稳定性增加可能是由于紧凑的 IPN 结构的形成和 MG 的半乳糖部分对胶原酶可能的非粘附特性。 增加的稳定性也可能部分归因于交联剂 PEGDA 对胶原酶等蛋白质的非粘附特性。

如图12所示，与在人角膜中的生长相比，细菌菌株在胶原蛋白和 CG2 水凝胶中的生长显着降低。这表明作为角膜替代品的 CG2 水凝胶可能比人类角膜具有更好的细菌抵抗力。

图13显示，当接种在 CG2 和单独的胶原蛋白水凝胶上时，角膜上皮细胞在 3 天内变得融合。

细胞计数（图14）表明，与仅含胶原蛋白的水凝胶相比，CG2 水凝胶更有利于上皮细胞过度生长。这表明 pMG 可能通过增强细胞粘附、迁移和增殖充当 GAG 模拟物。

冷冻切片并用 H&E 染色的培养的 CG2 水凝胶显示出两层或三层的复层角膜上皮细胞（图15）。体外结果表明，CG2 水凝胶具有生物相容性，可能具有作为板层角膜移植术角膜替代材料的潜在应用。

四、结论

由胶原蛋白和糖聚合物 pMG 成功地制备了具有互穿聚合物网络结构的水凝胶基质。复合水凝胶的光学性能优于或等同于人角膜。复合水凝胶的降解可以通过在制造过程中改变水凝胶中糖聚合物的含量来调节。

体外生物相容性和可缝合性结果恶魔指出生物工程复合水凝胶可以作为板层角膜移植术的角膜替代物的良好候选者。这些新型水凝胶是第一种由 ECM 材料和糖聚合物制备的生物工程材料，用于组织工程应用。

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