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文 | 薛铮铮aa
编辑 | 薛铮铮aa
磷脂酰胆碱是一种重要的生物分子，广泛存在于细胞膜中，并在生物体内中发挥关键作用。
同时为了深入了解磷脂酰胆碱的合成、代谢和功效，研究人员运用同位素标记法对其进行了深入研究。
近期 小分子质谱技术 的改进与创新，为深入进行生物学研究提供了强有力的工具，而这必将成为生物医学研究的“后基因组”的时代特征。
对于膜磷脂，利用串联电喷雾电离质谱（ ESI-MS/MS）类的尖端诊断负载的前体扫描，可以为数百种独特的负载类提供个体分子物种水平的详细定量。
只是这种“快照”测量很少提供关于负载的数据，然而，最近结合磷脂头基的稳定同位素协助标记，可以对未标记和标记片段进行前体扫描，从而使在体内对磷脂酰胆碱的深入研究变为了可能。
最近关于磷脂磷脂酰胆碱的研究显示，从亚细胞器的研究水平到整个有机体水平，这种强大的方法在寻求解决本体问题上的未来将成为动态光栅组学的核心。
磷脂酰胆碱（PtdCho）化合物
自 90 年代初以来，小分子质谱与“软”电离技术相关的进展，使 串联电喷雾电离质谱(ESI-MS/MS) 成为了理想的继承者。
PtdCho的两性离子胆碱头基易于电离，使其成为了在正电离条件下分离的特别容易的分子。
然而，当采用正电离中的碎片磷脂和质量/电荷 (m/z) 比为184+的PtdCho诊断碎片进行前体扫描时，获得的辨别力、灵敏度和特异性比传统方法的数量级更大。
从理论上来说，如果不是实践的话，每个碎片化的PtdCho分子的检测能力可能仅受质谱仪性能特征的限制。
对于生物膜样品，包含“非生理性”PtdCho分子种类内标和预先校准仪器的响应特性，该方法可以准确估计各个分子种类的浓度。
尽管对于人们而言，测量PtdCho分子的绝对组织浓度和比例肯定是可以做到的，但这些测量结果 仅仅反映了特定时间点下的数据 。
即使在生理极限条件下进行，它们也无法提供生成这些分子探针的吸附途径和通量的信息。
例如，对比在控制条件下生长的细胞，与在添加不饱和吸附情况下培养了数天甚至数周的细胞，便可以揭示出“终点”差异。
但只有通过稳定的同位素标记，才能揭示产生这些差异的潜在机制。
在此前，同位素标记前体物的首选方法通常是是跟踪生物分子，使用同位素来跟踪标记的胆碱头基。
但这同时是也一种不太理想的选择，原因便在于 这种方法极其昂贵 ，即使具有高比活性。
检测设定不仅会受到较小的输入量的影响，还受到[3H]或[14C]的衰退变化速率和计数效率的限制。
好在ESI-MS/MS提供了一条替代路径，它既更敏感，也更特异，而且还尤其便宜，可以实现系统稳定的胆碱头基同位素标记，尤其是胆碱-d9、胆碱-d13以及[13C]标记的替代物。
此时再结合 前体扫描技术 ，便提供了一个强有力的解决方案：
使用m/z 184+前体来确定未标记的PtdCho分子、使用m/z 193+前体来确定胆碱-d9、使用m/z 197+前体来确定胆碱-d13以及使用m/z 189+前体确定含有五个13C分子的胆碱，PtdCho分子的测定也因此得到了显著的扩展。
当同位素标记的分数达到饱和浓度时，稳定同位素标记的分数，则有效地代表了新合成的PtdCho分子，而m/z 184+前体则代表了 “内源性”PtdCho分子 。
这些研究被称为 “动态电位组学” ，其与更广泛使用的静态测量不同，是一种新兴技术，这种技术在未来几年可能会主导许多磷脂酶研究。
下表列举了稳定同位素标记在亚细胞、整个细胞和整个生物体研究中的一些应用示例，在后文中也会对这些示例进一步详细阐述。
通过确定的生物系统追踪氘化胆碱流量
亚细胞膜含有不同比例的PtdCho分子，这一观点不是近来才发现的，质膜PtdCho组成与内质网不同，而内质网的组成又与细胞核包膜、细胞核基质共定位的膜脂有所不同。
然而，尽管理论上可行，但由于分析的限制，无法“完成”解释 亚细胞异质性生成的空白。
异质在合成后可能存在多个合成位点，可用的底物池也不同，同时细胞内可能存在不同的输运现象，但放射标记又过于敏感，无法提供全面的信息，而且没有技术能够提供准确的答案。
在利用PtdCho膜合成的过程中，CDP胆碱通路的最终步骤，即启动二乙酰甘油与活化胆碱分子。
而参与CDP胆碱连接的乙酰胆碱磷酸转移酶，是在两个酶CEPT1和CPT1中表达的。
转染至CHO-K1细胞中，人类酶在细胞外核区域内显示出不同的位置，先与内质网/细胞核包膜共定位，后与高尔基体共定位。
每个酶的活性对整体合成贡献了约50%，尽管在细胞的其他位置也发生了明显不同的PtdCho生物合成，细胞核内区域仍是新生PtdCho合成的一个明显位置，但神经表面也出现了明显不同的PtdCho生物合成。
对体外封闭的CEPT1和CPT1的分析表明，关于新生PtdCho合成，二木质素物种具有一定分子选择性，但尚不做到在生物合成途径上选择使用胆碱-d9标记细胞，并分析其亚细胞通量。
对于可以在标记后分离的亚细胞区室，如细胞核基质获得和培育新合成PtdCho分子是很容易的。
然而，在细胞外核区域内，分离出没有高尔基体的内质网，在技术上面却更加困难。
间接评估分子电位的替代路径，是由胆碱磷酸转移酶提供的。
在TET-ON的控制下，于CHO-K1细胞内增加20倍的胆碱磷酸转移酶，可以让细胞更具有活性的同时，又不改变全细胞的PtdCho分子积累的速率。
因此，当细胞在强化诱导诱导后的24小时内标记胆碱-d9时，PtdCho分子的组成和合成模式向二木质甘油物种的偏好发生转变。
这与这些物种的分子电位或内质网/细胞核包膜中的亚细胞富集一致，通过对胆碱-d9色谱进行分析，观察到CEPT1的磁场增加，很可能会导致磷脂酶A1和磷脂酶A2活性的增加。
整个细胞中的PtdCho合成
在1999年的一项研究中，首次报道了利用胆碱-d9来表示整个细胞中的PtdCho合成，将种稳定同位素与乙醇胺-d4结合使用，使得能够同时确定并区分肝细胞中新生PtdCho合成的两个途径。
除了提供概念论证之外，这也是一次是开创性研究验证，PtdCho的分子支架主要来自于N-甲基化途径，而不是CDP胆碱途径。
这也使得磷脂醇胺（PtdEtn）转化为PtdCho，并通过脂蛋白途径输出。
虽然显著的活性N-甲基化作用导致了较低的组织作用，但最近一系列在花生酵母中使用类似方法的论文表明，CDP胆碱和N-甲基化途径也产生出了明显不同的分子物种谱。
上述的论文使用了胆碱-d13和甲基-d3甲硫氨酸来区分这两种途径，但本质上方法是相同的。
该情况下的前体扫描使用了m/z 184+、193+和197+，这些研究基本上均提供了 一种更快速的方法 ，来确定CDP胆碱和N-甲基化对整个细胞PtdCho产生的相对贡献，但同时又没有使用分子物种评估途径的复杂性。
内部的非增殖细胞可在维持表特征的同时快速发挥功效，包括对PtdCho分子物种组成机制的定义，且并不依赖于营养供应。
如果将用于探测胆碱-d9的逻辑 推演到一系列对整个细胞生物体的研究 ，例如萝卜和疟原虫的研究，有机体碱消耗的综合性质便为胆碱- d9在细胞水平的标记研究提供广泛的应用前景。
这一结论对PtdCho在器官和组织之间的输出和运输现象、细胞外对PtdCho周转的贡献、以及饲料和循环现象的研究都是适用的。
但考虑胆碱-d9的整体代谢水平，仍有一点需要注意，研究人员的报告显示，胆碱-d9在一定程序中可以实现甜菜碱降解，该途径通过保留超出有机体需求的胆碱中的甲基基团来进行。
通过将氘代甲基基团回收并纳入腺苷甲硫氨酸中，提供了将其最终引入由N-甲基化合成PtdCho的途径。
因此，在使用胆碱-d9标记整体生物时，m/z 187+和190+碎片前体，逐渐揭示了通过N-甲基化合成胚胎PtdCho分子的途径。
除此之外，重复骨髓与PtdCho的运输和周转过程，也可导致最终组织获得这些标记的头基团。
研究人员分别对注射了胆碱-d9（用以追踪PtdCho）和甘露醇-d6（用以追踪磷脂肌醇PtdIns）的小白鼠进行了研究。
又因为在那些可研究器官中，肺部是尤其重要的，所以对小白鼠 肺部的磷脂含量进 行了详细测量。
在磷脂方面，除了正常细胞生长和修复所必需的PtdCho合成之外，还需要测量肺表面活性磷脂的主要成分。
研究通过解析从痰液中取样的肺表面活性磷脂PtdCho中的胆碱-d9，评估出从静脉输入的胆碱-d9对身体产生的影响。
根据获取的数据，可以计算出表面活性磷脂PtdCho的合成模板、从棕榈热塑性磷脂基PtdCho、到二棕榈磷脂基PtdCho的重构以及周转/平衡时间。
但因为后续的研究缺乏相应的信息量，例如尚未使用ESI-MS/MS，对从气管抽吸物和肺癌泡灌洗物中的物质表征进行分级，所以目前还无法继续。
只是如果换个角度，参照气相色谱/质谱或气相色谱/同位素比质谱这些旁近数据，很可能在不久的将来从这些类型的分析中获得更多信息。
总结
近来稳定同位素标记与ESI-MS/MS磷脂分析技术已运用在一些领域，除了作为定性和定量测定PtdCho分子种类的辅助外，基于TOF质谱的次级离子效应，研究人员还开发出 一个更为广阔的应用领域 。
通过分析m/z 184+离子，可以对PtdCho分子进行拓扑学识别，在使用胆碱-d9标记后扫描m/z 193+离子，为人们在“可视化”新合成PtdCho分子的空间分配模式提供一条新的路径。
事实也证明，运用同位素标记法对磷脂酰胆碱进行深入研究，是一项非常重要的科学工作，通过追踪磷脂酰胆碱的合成和代谢过程，人们可以更好地理解其在生物体内的功能和作用机制。
同位素标记法与ESI-MS/MS磷脂分析技术，为磷脂酰胆碱研究提供了强大的工具，这有助于推动人们对生物体内磷脂酰胆碱代谢的深入认识，为相关领域的研究和应用提供新的突破和进展。
