革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)有三层细胞包膜：外膜（OM），肽聚糖细胞壁和内膜（IM） 。内膜是由磷脂分子组成的双层膜，上面镶嵌着具有各种功能的蛋白质；外膜主要由脂多糖（LPS）、磷脂和蛋白质组成，上面有许多的孔道蛋白。内膜在主动运输中发挥着重要作用，而外膜则具有重要的免疫学和病原学意义，还可以防止蛋白质从周质空间泄露 。
分离内膜和外膜不仅有助于研究细胞膜的组成结构和功能，破译细胞中蛋白质和脂质的位置和功能 ，还是使用苯乙烯-马来酸进行膜蛋白纯化的第一步 ，同样可以帮助我们深入理解细胞膜的作用机制。蔗糖梯度超速离心法是分离革兰氏阴性细菌内膜和外膜的最广泛的方法 。这些方法用溶菌酶/ EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸）处理细菌细胞，其中EDTA可以螯合二价阳离子，破坏相邻LPS分子之间的相互作用 。但是，EDTA对阳离子的螯合可能会影响某些需要二价阳离子（如Ca2+，Mg2+，Zn2+）来稳定其三级结构或/和保持活性的膜蛋白的功能或结构。
本篇protocol以分离大肠杆菌的内膜和外膜为例，向我们介绍了一种相对简单的蔗糖梯度超速离心方法。 该方法不使用溶菌酶或EDTA进行处理，有利于后续的膜蛋白纯化。相关工作以“Separating Inner and Outer Membranes of Escherichia coli by EDTA-free Sucrose Gradient Centrifugation”为题发表于 Bio-protocol 。
一、材料与试剂
1. 125 mL烧瓶（PYREX, 4980）
2. 2800 mL烧瓶（PYREX, 4420）
3. 移液器吸头
4. 血清移液管
5. 1 L离心瓶（Thermo Scientific, NalgeneTM, 3141-1006）
6. 70 mL超速离心瓶（Beckman Coulter, 355622）
7. 37 mL超速离心管（Beckman Coulter, 344058）
8. 组织研磨机（DWK Life Sciences, 8853030040）
9. LB培养基粉（Research Products International, L24400-5000.0）
10. TB培养基粉（Research Products International, T15100-5000.0）
11. 琼脂（BD, BactoTM, 214010）
12. Tris（American Bio, AB02000-05000）
13. 氯化钠（NaCl）（Dot Scientific, DSS23020-5000）
14. 甘油（J.T. Baker, 2136-03）
15. 硫酸卡那霉素（American Bio, AB01100-00010）
16. 壮观霉素（Research Products International, S23000-25.0）
17. 氯霉素（Sigma, C0378-25G）
18. 蔗糖（Sigma-Aldrich, S0389-1 KG）
19. IPTG (isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside) (American Bio, AB00841-00010)
20. PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) (Dot Scientific, DSP20270-25)
21. 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich, M6250-100ML）
22. 表达YejM / LapB复合物的大肠杆菌BL21 (DE3) star plysS菌株的甘油原液[10]
23. 盐酸（J.T. Baker, 9535-00）
24. LB培养基（见配方）
25. LB琼脂平板（见配方）
26. TB培养基（见配方）
27. 1 M Tris-HCl, pH 7.8（见配方）
28. 裂解缓冲液（见配方）
29. 稀释缓冲液（见配方）
30. 73%蔗糖（见配方）
31. 53%蔗糖（见配方）
32. 20%蔗糖（见配方）
二、仪器与软件
1. 移液管（P200, P1000）
2. 移液器（BrandTech Scientific, accu-jet pro）
3. -80°C超低温冰箱（PHCbi, MDF-U76VA-PA）
4. 微生物培养箱（VWR, F Air 6.3 CF）
5. 培养箱摇床（New Brunswick, InnovaTM 44）
6. 离心机（Thermo Scientific Sorvall, BP8）
7. 超速离心机（Beckman, OptimaTM LE-80K）
8. 高压微流化器（Avestin, Emulsi Flex-C3）
9. 固定角转子（Beckman Coulter, Type 45Ti）
10. 水平吊斗转子（Beckman Coulter, SW 28）
11. 超纯水系统（Millipore, Reference A+）
三、实验流程
A. 准备总细胞膜
1. 用表达YejM / LapB复合物的大肠杆菌BL21 (DE3) star plysS菌株的甘油原液在含有50 μg/mL硫酸卡那霉素、50 μg/mL壮观霉素和25 μg/mL氯霉素（Kan+ , Spe+, Cam+）的 LB 平板上划线。将平板置于37°C的微生物培养箱中孵育过夜。
2. 将过夜培养板中的单菌落接种到装有20 mL LB培养基（Kan+ , Spe+, Cam+，）的125 mL 烧瓶中。在37°C，220 rpm振荡过夜，培养细胞。
3. 将10 mL过夜培养物转移到含有1 L TB培养基（Kan+ , Spe+, Cam+，共2 L）的2800 mL 烧瓶中。在37°C下以220 rpm振荡培养至OD600为0.6.
4. 向1 L 细胞培养物中加入200 μL 1 M IPTG，终浓度为0.2 mM，将细胞在30°C，220 rpm 振荡孵育4小时。
5. 将培养物在4°C，5,000 × g离心10分钟以收获细胞。
6. 用含有1 mM PMSF和5 mM 2-巯基乙醇的40 mL裂解缓冲液（参见配方）重悬细胞沉淀。在此步骤中，重悬的细胞可以在液氮中快速冷冻并储存在-80°C超低温冰箱中，或直接进行步骤A7破碎细胞。
7. 将细胞转移到40 mL组织研磨机中，推拉研磨杵10-20次使细胞均质化。
8. 在高压微流化器中以15,000 psi的速度通过两次来破碎细胞。
9. 将破碎的细胞转移到50 mL离心管中，4°C，5000 × g离心10分钟。
10. 将上清液转移到70 mL超速离心瓶中，并加入裂解缓冲液补足至50 mL。小心平衡超速离心瓶。
11. 用贝克曼库尔特型45Ti转子40,000 rpm（185,677×g），4°C下超速离心2小时。离心后保留膜沉淀。
B. 分离内膜和外膜
1. 用40 mL组织研磨机将大约3 g膜沉淀重悬于55 mL的20%蔗糖中。
2. 准备六个37 mL超速离心管。每个试管从底部到顶部分别是14 mL的73%蔗糖、14 mL的53%蔗糖和9 mL的20%蔗糖的膜重悬液。
3. 用SW 28转子23,000 rpm (65,000 × g)，4°C离心18小时。
4. 离心后得到两个条带：上面的条带是内膜，下面的条带是外膜（图1）。
图1. IM和OM的分离
5. 切开P1000移液器吸头的末端约5毫米，使用切头的移液器收集上层内膜。
6. 使用新的移液器吸头并重复步骤B5以收集外膜层。
7. 将外膜和内膜转移到70 mL超速离心瓶中。向瓶中添加稀释液使最终蔗糖浓度小于10%。小心平衡超速离心瓶。
8. 用贝克曼库尔特型45Ti转子40,000rpm（185,677×g），4°C，超速离心2小时。
9. 弃上清液，称取膜的湿重。每克膜加入10 mL裂解缓冲液，用40 mL组织研磨机重悬。
10. 用液氮速冻膜，并储存在-80°C超低温冰箱中。
注意：
1.该方法使用表达YejM / LapB复合物的大肠杆菌BL21 (DE3) star plysS菌株作为分离内膜和外膜的示例。此方法也适用于其他大肠杆菌菌株。
2.该方案中使用的所有缓冲液均需要保持在4°C。
3.分离内膜和外膜时，每个37 mL超速离心管中不要添加超过0.5 g的总膜。否则，内膜和外膜可能无法很好地分离。
4.要通过超速离心机去除膜中的蔗糖，必须使最终蔗糖浓度低于10%。
四、配方
1. LB培养基
25 g LB培养基粉溶于1 L去离子水中。121°C高压灭菌30分钟。
2. LB琼脂平板
含1.5%琼脂（w/v）的LB培养基。
3. TB培养基
47.6 g TB培养基粉与4 mL甘油混合，溶于1 L去离子水中。121°C高压灭菌30分钟。
4. 1 M Tris-HCl，pH 7.8
将 121.14 g Tris溶解在800 mL Milli-Q水中，使用盐酸将pH值调节至7.8，用Milli-Q水补足1 L。
5. 裂解缓冲液
50 mM Tris-HCl, pH 7.8
300 mM NaCl
10%甘油（v/v）
6. 稀释缓冲液
50 mM Tris-HCl, pH 7.8
300 mM NaCl
7. 73% 蔗糖
73%蔗糖（w/v）
20 mM Tris-HCl, pH 7.8
8. 53% 蔗糖
53%蔗糖（w/v）
20 mM Tris-HCl, pH 7.8
9. 20% 蔗糖
20%蔗糖（w/v）
20 mM Tris-HCl, pH 7.8
五、原文信息
Shu, S. and Mi, W. (2023). Separating Inner and Outer Membranes of Escherichia coli by EDTA-free Sucrose Gradient Centrifugation. Bio-protocol 13(6): e4638. DOI: 10.21769/BioProtoc.4638. （原文链接： https://s.bio-protocol.org/5287abeff4d4bc54 ）
六、参考文献
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Bio-protocol 简介
Bio-protocol于2011年在斯坦福大学创建, 致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。 Bio-protocol 期刊是Bio-protocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今， Bio-protocol 已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的5000多篇实验方案，并且同 Science 、 eLife 等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年 Bio-protocol 期刊已被PubMed Central，ESCI收录。