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想要研究肠道菌群，一定绕不开 16S rRNA测序 。

关于测序的原理和步骤你是否了解呢？

另外，阅读文献时，也经常会看到一些专业名词（例如 OTU，alpha/beta多样性 等），它们又是什么意思呢？

今天我们就来聊一聊16S rRNA测序的相关知识，看完后这些疑问都能得到解答。

什么是16S rRNA？

16S rRNA是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分（长度约为1542nt），16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。

16S rRNA基因包括保守区和可变区 ， 保守区 反映了物种间的亲缘关系，而 可变区 则反映了物种间的差异。这两个区域呈交替排列（如下图），保守区可用于设计通用引物进行目的片段的扩增，高变区用于测序分析来辨别细菌种类。

可变区域的选择

从上图看到，16S rRNA序列包含 10个保守区（黑色部分）和9个高变区（橙色部分） 。目前，没有任何一个可变区可以准确的将所有种类的细菌从域到种进行明确分类，另外有一些可变区可以可靠的预测到特定的分类水平。不同的V区也会对原核微生物群落结构的分析结果产生明显的影响。

常见的测序区域包括单个V区（如V3，V4等）和片段区域（V1-V3，V3-V4等），它们之间的区别主要在于 测序长度和测序平台 。

一般来说， V3-V4区 是最常用的测序区域，它的测序平台为 illumina Miseq（PE300） ，该平台可完整覆盖该区域，对细菌的覆盖率较高； V4-V5区 是最佳的测序区域，其测序平台为 illumina Miseq（PE250） ，该平台特异性较好，具有很好“捕捉”细菌多样性的能力。

注意！这个规律也不是一成不变的，不同样本还需要不同对待 。可根据以往经验和文献进行选择。

测序样本数量的选择

一般 个体之间差别较小的模式动物 例如大鼠，小鼠，和兔子， 建议每组至少5个生物学重复，推荐每组有10个生物学重复 。

对于 个体间差别较大的 ，例如人类肠道粪便样本，需要加大取样量， 每组不少于30个为宜 。

测序的实验和分析流程

测序的过程大概包括以下几部分： 样本DNA提取；指定区域PCR扩增；文库制备，质检和定量；上机测序。

常见的分析流程如下图所示 。对原始数据进行质控以后，获得可以分析的clean reads。最基础的分析主要包括OTU的聚类和注释，多样性分析，样本间的差异分析。而想要深入研究的话，还需要涉及到一些 高级分析 ，例如菌落功能预测，菌群之间的相关性分析；多组学整合分析等。

常见的专业词

OTU 是在系统发生分析或群体遗传研究中的一个假定分类单元。 一般来说97%相似度聚类为一个OTU 。聚类分析后，会对OTU进行 注释 ，获得具体的物种分类。每个OTU对应一个种/属。

Alpha多样性 指的是一个特定区域或生态系统内的多样性，反映样本中微生物丰度和均匀度的综合指标。示意图如下，可以明确的看出不同组中菌群多样性的大小。

（此图来源于网页）

Beta多样性 是对不同样本/不同组间样本的微生物群落构成进行比较分析。示意图如下，可观察到不同组分之间的聚类和分离。

（此图来源于网页）

差异分析（LEfSe分析） 是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件分析，能够在组与组之间寻找 差异显著的菌群 。主要包括 LDA值分布柱状图和进化分支图 （下图）。柱状图中柱子的长短代表菌群丰度的大小，颜色代表不同的组。进化分支图中黄色的圆点代表差异不显著的菌，圈的直径大小代表菌落的相对丰度的大小。

基本的定义就介绍到这里啦，相信现在大家都对16S rRNA测序有了基本的了解。然而，只了解这些内容是远远不够的，今后我们还会给大家分享一些代表性的文献，基本的方案设计，以及写作中的注意事项，记得持续关注哦！