猪常见病毒病原学检测采样流程及应用

1、病原学检测采样流程

1.1 病毒

1.1.1. 概述

在兽医工作中，样品的采集是疾病正确诊断的关键，采样时机、采样方法、样品的保存和运输都会对最终的诊断结果产生影响。

适用于猪常见病毒病原学的检测有病毒分离和 PCR 两种方法。其中病毒分离主要

有猪胚接种、细胞接种和 猪接种三种方法。PCR 有常规 PCR、RT-PCR、荧光定量

PCR和斑点杂交等延伸方法。

1.1.2. 应用

猪常见病毒类疾病的诊断中，常规 PCR、RT-PCR 和荧光定量方法应用最为广泛，

其样品主要包括组织样品、棉拭子样品，具有操作简便、快速等优点。但由于病毒特点不同、所用引物存在差异等原因，存在假阴性、假阳性的干扰，因此多用于病原学的初步诊断，疾病的最终确诊还要依靠病毒分离或动物回归性实验或血清学等方法的相互验证。

1.1.3 样品要求

1.1.3.1 根据主要的剖检症状，做出初步判断，选取能代表整群发病特征的猪，采集典型的、有共性病变的样品，以提高检出率（详见表 2：猪病毒性样品采集参考表）；

1.1.3.2 多选择发病初期且有典型临床症状的病猪或新鲜死亡猪，要尽量保证样品的新鲜和全面。

1.1.3.3 通常按猪个体进行采集，一个群体相同的病例可以将多只猪的样品混合成一份进行检测。用于病毒分离或者 PCR 检测的组织样品量不是越多越好，更不是越大越好，指甲盖大小即可，以避免无病毒增殖部位对样品中病毒含量的稀释，从而降低检出率。

1.1.3.4 在采样过程中一定要采取措施，避免不同样品组间的交叉污染，重视采样器械的消毒（每次使用前酒精棉球擦拭后，用酒精灯灼烧法）。

1.1.3.5 用于病毒分离的样品，采集过程中注意避免与消毒剂的接触，以防病毒被人为灭活，保存和运输过程中避免反复冻融，以保证病毒的活性。

表2 猪病毒性疾病样品采集参考表

1.1.4 采样流程

1.1.4.1 采样工具

口罩、一次性手套、乳胶手套、防护服、剪刀、镊子、酒精棉球、干棉球、塑封袋、记号笔、棉拭子、离心管、注射器、塑料包装袋、封口膜和冰袋等。

1.1.4.2 采样步骤

1) 组织样采集

常规方法剖检猪，根据临床症状和组织病变情况做出初步判断，选取具有典型病变特征的组织块或疑似疾病的最高含毒靶器官采样。选择新鲜、有代表性的样品。尽量避免在发病后期采样。在不能确定 发某种病的情况下，病料的选择要全面。如果从死亡动物尸体上采集样本要注意 死亡时间：夏天应少于 6h，冬天最长不能超过 24h。尸体剖开腹腔时，应第一时间采集病料。病料采集时，对采集病料的器械及容器必须提前消毒，以免对病料 造成污染。

采样人着一次性防护服，戴一次手套，在猪舍外进行剖检和采样，剖开腹腔后，第一时间无菌用刀切取病变部位的肝、脾、肺、肾、淋巴结、流产胎儿、扁 桃体等病料，无菌采集 1-2cm3 小方块即可。每个组织分别放到 自封袋内，密封好。注意在选择样品采集部位时，最好采集病变和健康交界部位的组织或脏 器。病料的采集必须采用无菌操作。

2) 液体样品的采集

包括关节液、脓汁和渗出物（心包积液和腹水等）等，可用灭菌注射器直接吸取或用灭菌棉拭子采集。

全血的采集:采血前，按1∶ 5 体积在灭菌的注射器内吸入灭菌的抗凝剂(肝素或5%

的柠檬酸钠 )，无菌抽血后缓慢混匀。

3) 拭子样采集

采样的种类与数量：依据采样部位不同，拭子样品分为口拭子、鼻拭子、血拭子和肛拭子等。样品的数量应满足统计学的要求，用于疫病诊断时，应采集不少于5-10只病死动物样品，采样量要充足，能满足复检和留样备份。

物品器械：无菌棉签（或商品棉拭子）、PBS 保存液或生理盐水、3 mL离心管、剪刀、镊子等。

采样前准备：采样和保定人员穿戴好防护用品，加 PBS 保存液 1～2 mL 于无菌离心管。

保定：横卧保定法：适用于保定中猪。一人抓住猪的一只后腿，另一人抓住猪的耳朵，两人同时向一侧用力将猪放倒，并适当按住颈及后躯，加以控制，即可进行诊治。鼻绳保定法适用于大猪和性情凶猛的猪保定。用一条2米长的麻绳，在一端做成直径约15-18厘米的活结绳套，从口腔套在猪的上颌骨犬齿后方，将另一端拴在柱子上或用人拉住，拉紧活套使猪头提举起来。无论猪体多大，用此法固定时都极为老实，站在原地不动。

采样：口拭子采集方法：右手持无菌棉签，将无菌棉拭子插入猪口腔中，约5－10cm深，转动棉拭子顺时针和逆时针擦拭口腔数次。拿出棉拭子放到加有2－3mL生理盐水的试管中，挤压几次，并折断木棒，拧上离心管管盖。鼻拭子采集方法:绑定猪只，右手持无菌棉签，将无菌棉拭子斜45度角插入猪鼻腔中线附近，约5－10cm深，把鼻拭子贴着猪鼻腔周壁顺时针擦两到三圈，然后逆时针擦拭，然后换一个鼻孔重复这套动作，保证拭子看起来湿润。拿出棉拭子放到加有2－3ml生理盐水的试管中，挤压几次，并折断木棒，盖上离心管管盖。血拭子采集方法：先用酒精擦拭耳缘或尾根部采血区域，用一次性注射器或采血针刺破并挤压 出少量血液，用无菌棉拭子反复擦拭流出来的血液，将棉拭子放到加有2－3ml生 理盐水的试管中，挤压几次，并折断木棒，挤上离心管管盖。肛拭子采集方法： 绑定猪只，右手持无菌棉签，将无菌棉拭子斜插入猪肛门中，约5－10cm深，把棉拭子顺时针擦两到三圈，然后逆时针擦拭，保证拭子看起来湿润。拿出棉拭 子放到加有2－3ml生理盐水的试管中，挤压几次，并折断木棒，盖上离心管管盖。

1.1.4.3 注意事项

采集人员需要穿防护服，戴手套、帽子，采集完后进行场地、解剖台等的消毒，用过的防护用品无害化处理，防止病原人为散毒。

器械消毒: 多次解剖用到的剪刀、镊子使用前必须消毒 ( 酒精棉擦拭干净后，在酒

精灯火焰上烧干，待冷却后使用 )；盛放待检样品的容器也要提前灭菌和消毒（如，EP

管经高压灭菌）；避免样品间的污染，原则上细菌污染越少越好。

1.1.5 样品标记

样品应以样品袋或棉拭子管为单位进行标记，标明采样日期、日龄、样品名称、农场名和猪舍号等信息。

1.1.6 保存

如样品能在采样当天进行检测，可将样品 2-8℃保存；如待检时间较长，要将样品置

于 -20 度冷冻保存。注意样品避免反复冻融。

送检样品的记录和送检单填写：送检样品记录至少要有一份备案，一份随样品送往

化验室。填写内容至少包括：（1）动物饲养场的场名、地址、场主姓名、联络方式、采

样日期、送检人的姓名及联络方式；（2）送检样品的名称及数量；（3）检测内容和方法；

（4）送检日期；（5）免疫情况；（6）目前饲养的数量及首发病例和继发病例的日期，

出现的临床症状、发病数、死亡数、治疗史等。

1.1.7 样品包装

采集的样品要用自封袋做好密封，最好能在 24h 内送达实验室 ( 夏天需 4℃左右

冷藏 )，如不能在 24h 内送检，要把样品先行冷冻。

1) 工具：纸箱、泡沫箱、胶带、缓冲物（泡沫 / 报纸）、冰袋、记号笔等

2) 步骤

样品整合：检查已冷冻且标记好的装有样品的自封袋是否密封严实，再将其装入一

个大一点的自封袋内进行整合，封口前，排除多余空气；

“汉堡打包”：用气泡泡沫紧密包裹样品袋，然后用塑料胶带固定，这种打包法适用

于易碎样品和液体样品；

泡沫箱准备：泡沫箱底层放置缓冲物，将打包好的样品至于泡沫箱中，四周放入适

量冷冻的冰袋以确保整个运输途中样品仍处于低温环境，冰袋数量依运输时间和季节增

减；样品上层和其他部位用缓冲物填充，以防止运输途中样品受到剧烈震荡而受损。

包装：盖上泡沫箱盖子后，用塑料胶带密封盖子四周。将整个泡沫箱放置于纸箱中，

箱内放入送检单，用塑料胶带密封整个箱子。最后用标记笔在箱体标记必要的标识，比如

“易碎勿压”、放置的方向等。

棉拭子样品也适用于上述包装方法；

1.1.8 样品运输

运送样品时尽量选择运输速度快的公司，保证所采集的样品及时送达，另外还需注意，对外包装进行加固，防止压碎、摔烂等情况发生。最后，及时与物流公司沟通，确保领取方便快捷，比如通过客车运送时，提供何地发往何处的客车，司机电话和车牌号等。

1.2 细菌

1.2.1 概述

细菌的病原学检测能帮助确定猪感染的细菌种类，同时也可根据药敏试验结果，指导临床有针对性的用药，避免药物滥用及耐药性的产生，快速控制疾病，降低生产损失，但有时无法判断是原发还是继发感染。

1.2.2 应用

常见的细菌病原学检测方法有分离鉴定法和 PCR 等。细菌的分离是指通过人工培养

的方法将病变组织或者器官中的细菌在某些适宜培养基中进行增菌繁殖，而后可供生物化学

或者分子生物学的方法进行鉴定。有一些成熟的商品化培养基可用于细菌的初步鉴定培

养，他们主要是基于不同细菌在特定培养基上的不同生长特点作出鉴定，例如大肠杆菌在

麦康凯培养基成红色菌落，沙门氏菌在 SS 培养基上呈中心为黑色的菌落。基本上所有细

菌都可以用 PCR 方法进行检测。

1.2.3 样品要求

1) 猪群发病初期采样，采集相应的病变部位；

2) 样品新鲜；

3) 样本采集时应严格无菌操作，避免杂菌污染；

4) 用于细菌分离的样品应放置于预先灭菌容器内；

5) 应在猪只使用抗菌素及药物治疗前采集样本；

6) 盛样本的容器不得用酸碱或消毒剂处理。

1.2.4 采样流程

1.2.4.1 采样工具

无菌采样需要的工具：剪刀、镊子、酒精灯、消毒棉球、无菌容器、特定培养基等。

1.2.4.2 采样步骤

猪常见的细菌有猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪波氏杆菌、猪巴氏杆菌、大肠杆菌、魏氏梭菌、猪沙门氏菌和胸膜肺炎放线杆菌等。通常采用烧烙法消毒进行实质脏器的取材。

不同类型病料样品无菌取样方法及要求：

液体样品（血液、胆汁、渗出物、脓汁等）：烧烙包膜表面，无菌注射器吸取并转

移至灭菌容器后送检。

肠内容物：烧烙表面，用注射器吸出内容物；或两头双道结扎肠管，置于灭菌容器

中送检。

组织器官：现场条件有限的情况下，直接采取目标组织器官，置于灭菌的培养皿或

其他容器中（如肝脏、肠管、关节、脑部等）。

猪常见不同细菌病及采样部位见表 3。

表3 常见猪细菌病及采样部位

1.3 支原体

1.3.3 概述

猪支原体属原核生物，无细胞壁，由细胞膜包裹。迄今为止确认对猪致病的支原,体有2 种，包括猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)和猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis，Mhp）。

目前检测方法主要有分离培养法、血清学方法以及分子生物学方法。由于支原体对生长条件要求苛刻，培养基制备复杂，培养时间长，操作繁杂，分离培养不能满足快速诊断的需要。血清学方法包括平板凝集反应、试管凝集反应和酶联免疫吸附法（ELISA），其中酶联免疫吸附法（ELISA）是目前常用的血清学诊断方法，具有快速和准确的特点。PCR 方法操作简便，速度快，敏感性远高于前两种方法，可应用于该病的早期诊断和检疫，但对实验室条件要求高，检测时常因*制剂抑**等因素干扰，而可出现假阳性结果。

1.3.4 应用

1)分离培养法主要应用于从病料中分离和培养支原体，可为进一步的药敏试验、镜检、

生化试验、PCR 等进一步的诊断和研究提供素材。培养基分为液体培养基和固体培养基，有些支原体培养难度较大，需要添加醋酸铊和调整 pH 值。

2) 病原菌鉴定主要有姬姆萨染色镜检、生化试验和血清学试验。

3) 商品化的ELISA 试剂盒目前多用于评估免疫后的抗体水平，也可用于支原体的定性诊断和流行病学监测。

4) 分子生物学方法主要应用于支原体的快速诊断和分型。

1.3.5 样品要求

1）病原分离样品要求：典型症状的活猪或活猪咽喉拭子样品。

2）PCR的样本要求：可直接使用鼻腔拭子、气管、支气管、肺、关节组织和分泌物进行检测。也可用棉拭子从病变关节液进行采样。

1.3.6 采样流程

1) 直接送检病症典型的活猪或新鲜死亡猪。

2) 组织样品：安乐死处死病猪，常规剖检；直接采集气囊、气管、支气管、肺等组织照1.1.4。

3) 棉拭子：蹲于猪的左侧，左手抓紧实验猪的上下鄂，使猪嘴紧闭，右臂肘部与右腿将实验猪颈部夹住，对其进行固定。当实验猪情绪稳定后，右手持棉签，将棉签与猪鼻中隔成45°角轻轻插入，遇到鼻中隔后，稍作拐弯，绕过骨状辨膜，与鼻中隔平行方向插入约2cm。轻轻转动棉签，刺激实验猪的喷嚏反射，当打2~3个喷嚏后，轻轻拔出棉签，放入1mL样品贮存液中，折断多余部分的棉棒，密闭收集管，标号后于4°C保存。

1.3.7 样品标记

样品应以样品袋或棉拭子管为单位进行标记， 标明采样日期、日龄、样品名称、农场名和舍号等情况；

1.3.8 样品保存

最理想的状态是将病猪的样品（拭子、分泌物和小的组织样品）直接接种到培养基，

然后立即置 37℃培养，若不能立即培养，则需要把接种好的培养基置 4℃保存（不超过24h）。当日能送达实验室，样品冷藏保存和运输；若当日不能送达实验室，样品需及时冷冻存放。支原体在 -80 ℃条件下能存活一年以上，在支原体冻干保护剂中能存活 10 年以上。