PCR是一种选择性体外快速扩增DN*片A**段的方法。在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程,以拟扩增的模板DNA分子,与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系,经过重复地变性一退火一延伸三步,扩增新的目的DNA链,这个过程通过控制反应体系的温度来实现。
PCR包含下列三步反应:
1、变性(denaturation)
将反应体系混合物经加热至94℃左右,维持较短的时间,使双链DNA变成单链DNA,便于下一步引物的结合。
2、退火(annealing)
将反应体系温度下降到特定温度(一般是引物的Tm值以下),引物与DNA模板以碱基互补的方式结合,形成模板-引物杂交双链。退火温度是保证引物与DNA模板互补结合的关键。由于引物结构简单,加之引物量远远大于模板DNA的数量,所以DNA模板单链之间的互补结合很少。
3、延伸(elongation)
将反应体系的温度上升到72℃左右并维持一段时间,在Taq DNA聚合酶的作用下,以引物为起始点,以4种单核苷酸(dNTP)为底物,从5'→3'方向延伸反应,合成新的DNA双链。
以上三步反应为一个循环,重复进行变性、退火、延伸这三步反应,如此反复循环可以使DNA以指数形式进行扩增。上述过程1.5小时左右完成,从而使所需的目的DN*片A**段扩增放大百万倍。
PCR(聚合酶链式反应)技术普及度较高,适合已知基因靶点和对检测效率要求较高的检测,因其“简便、快捷、性价比高”的属性被广泛应用于医学检验、法医鉴定、食品安全等领域。在过去的数十年间,PCR已被确立为多种疾病的标准诊断方法,在COVID-19疫情期间,PCR亦被认可为诊断是否感染新冠病毒的“金标准”。
dPCR虽然优点显著,但是对于多靶点(target site)的检测却存在着明显的限制。
首先是PCR-base技术的共性问题:非特异性扩增引起的不同靶点扩增互相干扰(一般极限值是20个)、阴性阳性信号分辨率不足等。在尝试增加检测通量时,dPCR通过信号强度区分有极限,通常以区分阴阳性为主,通过设计最多一般只能区分强阳、中阳、弱阳和阴性。此外,由于大多数平台的多重荧光通道只允许每个荧光通路识别一个目标。通过多荧光通道加持实现扩大检测靶点数,最多也只能同时进行6-8个靶点的检测,而且会造成检测系统成本的增加。为了解决dPCR信息通量低的问题,创新性研发了“高通量PCR”技术平台,相对于传统PCR技术,高通量PCR在dPCR高灵敏度核酸定量检测的基础上,单管可同时检测上万重靶点。
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