作者：王璐，韩世愈

单位：哈尔滨医科大学附属第四医院妇产科

卵巢癌是癌症死亡的第五大常见原因，也是妇科癌症死亡的最主要原因。通常当肿瘤局限于卵巢时，卵巢癌治愈率达90%，而事实上约75%的卵巢癌在晚期才确诊，此时肿瘤早已发生转移，因而治愈率大大降低。临床上常见的检测卵巢癌的方法有肿瘤标志物［如血清癌抗原125(CA125)、人附睾蛋白4］联合超声、CT、磁共振成像等影像学检查，以及近年来应用较多的乳腺癌易感基因1/2(BRCA1/2)基因检测，其中最常用的检测手段是血清CA125联合经阴道超声检查，但有研究认为两者联合对卵巢癌进行早期筛查并不能降低死亡率。截至目前，组织活检仍是诊断卵巢癌的金标准，但其具有侵袭性，且成本高、耗时长，并有造成肿瘤播散的风险，因此寻找新的、非侵入性的检查方法以期早期诊断卵巢癌、识别卵巢癌高风险患者、实时监测治疗反应以及评估预后是临床亟待解决的问题。

液体活检是一种非侵入性诊断方法，是检测血液、尿液等体液中的循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、外泌体及肿瘤相关血小板等循环生物标志物，液体活检较传统活检更加安全、方便。以往认为，卵巢癌的主要转移途径是直接蔓延、腹腔种植和淋巴转移，但现有研究表明血源性转移是卵巢癌转移的另一种重要方式。现就卵巢癌液体活检常用的标志物进行综述，以期为卵巢癌临床诊疗工作提供帮助。

1.液体活检概述

液体活检是以血液、唾液、尿液、脑脊液、胸腔积液及腹水等体液为检测样本获取肿瘤相关信息的技术，主要检测内容包括CTC、ctDNA、肿瘤细胞来源外泌体和肿瘤相关血小板等。液体活检被定义为一种早期癌症检测方法，其中CTC和ctDNA已被美国食品药品管理局批准用于临床。

组织活检是临床诊断癌症应用最多的检查方法，尽管其能提供有关肿瘤性质的信息，但单次活检并不足以描述肿瘤的遗传异质性，也无法提供肿瘤基因组的全面信息，除对患者有侵入性外，还存在固有风险和潜在并发症，甚至可能造成肿瘤扩散，因此组织活检并不适用于肿瘤的早期筛查，而液体活检不仅能在症状出现之前发现癌症，还能用于制订癌症晚期治疗决策。液体活检具有非侵入性、准确性高、取样风险低、取样限制少、样品制备简便等优势，并可反映出肿瘤基因组的全部信息，其在卵巢癌的筛查和诊断中有重要作用。

1.1 CTC

CTC是指因自发或诊疗操作而从实体肿瘤原发灶或转移灶脱落至外周循环中，少数仍具有高活性、能逃离机体免疫损伤而存活，并通过血液运行转移到其他组织器官并形成转移灶的肿瘤细胞。1998年，CTC首次从血液中分离并被证实与肿瘤病理分期相关。此后，CTC被越来越多地应用于临床，并在更多实体上皮癌的远处转移灶中发现。

CTC的逃逸机制目前尚不明确，但可以肯定的是同一类型癌症的不同患者，甚至同一患者的癌细胞之间也存在较大的分子和细胞异质性。血液中CTC数量极少，在晚期癌症患者的血液循环中，每10亿个血细胞中才有1个CTC，而液体活检中CTC检测除了计数单个CTC评估癌症外，还能提示CTC的分子表征，包括治疗靶点和耐药机制。CTC的半衰期很短，大约4h，这一特性决定CTC的检测结果具有较强的实时反应性，可作为动态监控的一种靶标物，同时这一特性也说明，除了活性CTC，外周血中还能检测到破碎或凋亡的CTC，这使得CTC的检测结果存在一定误差，但只有活性CTC对评价肿瘤转移有意义。

1.2 ctDNA

ctDNA是指肿瘤细胞释放到血液系统中的循环游离DNA(cfDNA)。1948年Mandel和Metais首先报道了血液中的cfDNA，1966年在系统性红斑狼疮患者中发现了cfDNA的存在，但直到1977年在胰腺癌患者中发现cfDNA水平的升高，cfDNA才进入肿瘤学领域，而从胰腺癌患者血浆样本中检测到ctDNA中的KARS基因突变才使人们真正意识到ctDNA作为肿瘤生物标志物的适用性。目前ctDNA是液体活检中最常用的血源性标志物之一，但由于ctDNA高度碎片化、半衰期短且含量极低等，其检测技术需要极高的特异性和敏感性。近年来，随着检测技术的进步和优化，最终形成了目前最常用的3种ctDNA检测技术:富集聚合酶链反应、数字聚合酶链反应和下一代测序技术。

1.3 外泌体

外泌体是生理或病理状态下包括正常细胞/肿瘤细胞等几乎所有类型细胞经胞吐作用释放到细胞外的具有脂质双层膜结构的纳米级小囊泡，直径为40～100 nm。外泌体是各种从正常细胞和肿瘤细胞脱落下来的膜囊泡，几乎存在于所有体液(血液、尿液、腹水、母乳等)中，尤其是血液，外泌体不仅是细胞间通讯的基本介质，还调节并参与包括癌症在内的众多生理和病理过程，且越来越多的研究提示外泌体可促进肿瘤细胞的生长、转移以及血管生成，介导肿瘤免疫应答，激发化疗抗性。

外泌体内含有大量细胞来源的分子，包括蛋白质、鞘磷脂、神经节苷脂和其他脂类以及大量核酸物质［如微RNA(miRNA/miR)、长链非编码RNA(lncRNA)、信使RNA等］，这些分子在细胞迁移、入侵及蛋白质复合物定位中发挥作用。与CTC相似，外泌体由于携带了特异性核酸和蛋白质，在研究中应用多种标志物结合以及反转录-聚合酶链反应扩增技术检测RNA作为主要检测手段。

miRNA是一类内源性表达的非编码单链小RNA，长度为19～25个核苷酸，主要通过抑制翻译或降解靶标信使RNA进而调节相关基因的表达，可作为肿瘤抑制因子或致癌基因参与肿瘤的发生、发展，在卵巢癌的发病中发挥重要作用。外泌体可将miRNA包裹其中，对抗富含RNA酶的血液环境，保护miRNA运输。lncRNA由200多个核苷酸组成，参与多种关键的生物学行为，包括印迹基因组位点、塑造染色体构型、调节酶活性等。

有研究表明，lncRNA通过与其他细胞大分子(包括DNA、RNA、蛋白质)相互作用驱动多种重要的癌症表型。在卵巢癌患者中，miRNA和lncRNA是研究和分析的主要外泌体成分，而磷脂酰丝氨酸、聚糖和糖蛋白等其他生物活性分子也可作为外泌体部分进行评估。由于外泌体具有分离试剂盒可广泛获得、存在特异性标志物、循环稳定性以及外泌体核酸与肿瘤核酸的精确表达等优势，与其他生物标志物相比，外泌体在液体活检技术中应用前景更广阔。

2.常用液体活检技术在卵巢癌中的应用

2.1 CTC在卵巢癌中的应用

目前已有多种方法利用CTC与健康循环细胞在物理、生物及功能特征等方面的差异对CTC进行富集、分离和鉴定，其中CellSearchⓇ平台是美国食品药品管理局唯一批准的临床应用的CTC。此外，其他方法虽未获得临床批准但也用于包括上皮性卵巢癌在内的多种恶性肿瘤实验室CTC的检测。Suh等收集87例术前未明确附件包块性质患者的血液标本行CTC检测，与其他术前诊断方法(如血清CA125、卵巢癌恶性肿瘤风险算法、恶性肿瘤风险指数、CT或磁共振成像)相比，CTC检测在发现早期癌症(Ⅰ期和Ⅱ期)方面更敏感，提示术前CTC检测不仅在区分附件肿块良恶性方面具有重要作用，还有助于提高癌症的早期筛查率。

Zhang等收集109例上皮性卵巢癌患者的211份血液样本，采用免疫磁珠筛选法检测CTC，并对其中51例患者的153份血液样本同时行CTC和CA125检测发现，在90%的初诊患者中检测出CTC，且CTC的数量与分期有关，ⅠA期和ⅠB期患者CTC阳性率远高于CA125阳性率，提示CTC检测在诊断早期上皮性卵巢癌方面优于CA125检测，同时也提示CTC检测可用于早期上皮性卵巢癌的筛查。Lou等收集49例新诊断为盆腔肿块女性的全血，比较术后经组织病理学诊断为卵巢癌的患者中CTC的存在情况，结果发现，良性盆腔肿块患者血液中不存在CTC；诊断为卵巢癌的患者中有17%存在CTC，且存在CTC的卵巢癌患者均处于Ⅲ期或Ⅳ期；其他肿瘤卵巢转移者中有80%存在CTC，说明与原发卵巢癌相比，CTC在其他癌症卵巢转移者中更为普遍，提示可根据CTC的数量和存在与否区分良性疾病、卵巢癌和其他癌症卵巢转移。

Banys-Paluchowski等选取43例癌症患者(其中34例卵巢癌、5例输卵管癌和4例原发性腹膜癌)分别给予标准化疗方案治疗，并于化疗前、化疗3个周期及化疗6个周期后使用CellSearchⓇ系统行CTC检测，结果发现，化疗后CTC计数迅速下降，提示CTC检测可用来监测化疗前后病情变化以及评估化疗疗效。但鉴于全身治疗期间CTC计数下降迅速，提示CTC可能不能识别出具有特定复发风险的患者，因此CTC检测鉴别实体肿瘤的潜力还需要进一步研究。

2.2 ctDNA在卵巢癌中的应用

ctDNA特异性突变检测是卵巢癌非常重要的液体活检方法。体细胞TP53基因突变是高级别浆液性卵巢癌的定义特征，Parkinson等对318例高级别浆液性卵巢癌患者治疗前的ctDNA进行分析发现，ctDNA与肿瘤体积呈正相关；对于腹水患者，引流出癌性腹水后，ctDNA与肿瘤体积的相关性增强，化疗1个周期后TP53最小等位基因频率≤60%与较快的肿瘤进展时间相关。

以上结果为ctDNA成为高级别浆液性卵巢癌高度特异的早期分子标志物提供了依据，但未来还需要进行更深入研究。Balaji等对包括卵巢癌在内的180例癌症患者的血浆样本进行分析发现，手术或组织活检前患者血浆中ctDNA的水平与总体生存相关，高水平ctDNA与不良生存结局相关。以上研究提示，ctDNA有可能成为癌症各阶段制订治疗决策和管理患者的强大工具。

此外，来自约翰霍普金斯大学的研究人员在2018年提出了一种名为CancerSEEK的ctDNA检测方法，他们利用该方法对1 005例非转移、特定器官肿瘤患者以及812例无癌症史的健康者进行单一的血液检测(16个基因和8个蛋白)，同时评估了8种早期癌症(卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、结直肠癌、肺癌和乳腺癌)患者中ctDNA的情况，结果显示在8种癌症中，CancerSEEK检测的阳性中位数为70%，ctDNA检测卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌以及食管癌5种癌症的灵敏度为69%～98%，其中卵巢癌为98%，CancerSEEK检测的特异度大于99%，812例健康者中有7例检测为假阳性。由此推测，ctDNA检测可用于卵巢癌的早期筛查。

但该项研究也存在局限性，如仅使用健康者作为对照样本，在真正的癌症筛查环境中，一些患者由于患有炎症或其他疾病，可能会导致假阳性率高于此研究结果，因此该方法距投入临床应用还有一定距离。ctDNA除应用于卵巢癌的早期筛查外，还能为卵巢癌靶向治疗药物选择提供依据，推动靶向治疗发展。

有研究发现，在铂耐药或难治性高级别浆液性卵巢癌中检测到BRCA回复突变，而BRCA回复突变与多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶*制剂抑**治疗效果降低有关。ctDNA作为一种非侵入性检测方法可以及时有效地检测到BRCA回复突变，从而预测多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶*制剂抑**耐药，并有可能提供有关肿瘤异质性的信息。

2.3外泌体在卵巢癌中的应用

Sherman-Samis等在卵巢癌患者的渗出液中成功检测到含有Nanog蛋白的外泌体，含有Nanog蛋白的外泌体可增强卵巢癌细胞的侵袭、迁移，并提高基质金属蛋白酶9的活性。Wang等发现，卵巢癌来源的外泌体miR-205能促进卵巢癌细胞增殖，抑制凋亡，并加速癌细胞的迁移和侵袭。肿瘤血管生成是肿瘤侵袭性的重要特征，其能促进肿瘤细胞增殖、侵袭以及转移。有研究表明，外泌体miR-205可通过诱导肿瘤血管生成促进卵巢癌转移。

近年来，有研究报道了卵巢癌患者血液样本中的lncRNA(如猫白血病病毒C亚类受体1反义RNA1、用于激酶活化的长基因间非编码RNA、反义缺氧诱导因子)参与了卵巢癌的发生和进展，通过检测癌症相关基因可调节卵巢癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，其中一些有可能成为卵巢癌诊断和预测预后的生物标志物或治疗靶标。Qiu等发现，上皮性卵巢癌循环外泌体中属于lncRNA的人类肺腺癌转移相关转录本1可促进血管生成，其水平也与患者预后相关。

另一项研究证明，卵巢癌细胞分泌的细胞外囊泡中的miR-141-3p可促进内皮细胞迁移和血管生成。Cao等研究表明，外泌体中的DNA甲基转移酶1可使宿主卵巢癌细胞对顺铂产生耐药性。Kanlikilicer等发现，在卵巢癌来源的外泌体中表达的miR-1246通过影响M2型巨噬细胞，介导卵巢癌中紫杉醇耐药。但并非所有外泌体均能起到促进作用，有研究表明，外泌体miR-6126是一种肿瘤抑制因子，可降低体外卵巢癌细胞的侵袭性。此外，外泌体中属于跨膜糖蛋白的去整合素金属蛋白酶15也起着肿瘤*制剂抑**的作用。

以上来源于卵巢癌的外泌体对于卵巢癌的早期诊断具有较高的参考价值，但这些生物标志物进入临床前还需进一步验证。

2.4肿瘤相关血小板在卵巢癌中的应用

血小板是起源于骨髓的循环无核细胞碎片，在止血和伤口愈合中起着至关重要的作用。近年来发现血小板在肿瘤发生发展中发挥作用，在肿瘤生长过程中，血小板与肿瘤细胞相互作用后，导致的与肿瘤相关的生物分子转移和血小板激活可诱导前信使RNA的特异性拼接，该剪接事件还依赖于肿瘤、基质细胞和免疫细胞的刺激。因此，肿瘤特异性剪接的前信使RNA和摄取的生物分子(包括血小板中的信使RNA)具有诊断癌症的潜在价值。

Cho等发现，将血小板输注到患有卵巢原位癌的小鼠体内可增加肿瘤细胞的增殖指数，表明血小板对肿瘤细胞有促增殖作用。研究发现，与血小板计数正常的卵巢癌患者相比，伴有血小板增多症的卵巢癌患者的肿瘤细胞增殖指数更高，表明血小板在体内外均可促进卵巢癌细胞增殖，这拓展了对血小板促进肿瘤进展机制的理解。Best等从健康个体中检测出肿瘤相关血小板，其区分恶性、转移性肿瘤患者的准确度为96%，分析其RNA图谱变化，成功定位原发肿瘤，准确度为71%，提示肿瘤相关血小板中存在显著的肿瘤类型特异性剪接。以上研究表明，血小板增多、肿瘤相关血小板及RNA谱都可能成为癌症筛查、诊断、预后以及治疗监测的有效生物标志物。目前关于肿瘤相关血小板在卵巢癌中适用性的评估尚处于起步阶段，需要进一步的临床试验来验证卵巢癌与这些特征之间的相关性。

3.小结

尽管对卵巢癌进行了广泛的研究，但缺乏特异的诊断和预后评估方面的生物标志物是导致卵巢癌患者生存率低下的原因之一。液体活检是临床肿瘤学的一项突破性技术，在筛查和诊断卵巢癌方面有巨大潜力，但将其应用于临床前还存在以下问题:①技术限制，如分离和定量过程的标准化、分析前后的质量控制以及基础分析的验证；②确定生物标志物和潜在的质量标准后，其临床意义(对早期发现、治疗效果和生存率的影响)必须在更大样本量中验证。通过不断克服应用限制，液体活检技术在卵巢癌的筛查、诊断及预后评估等方面的应用前景将更加广阔。

整理自：医学综述2022年5月第28卷第10期