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根据世界卫生组织的预测， 女性不孕症的发病率约为 9% 至 18%， 在不久的将来将成为继癌症和心血管疾病之后的第三大常见疾病。
临床数据显示， 子宫内膜基底层创伤引起的宫腔内粘连（IUA）可导致各种女性生殖健康问题，包括剧烈或慢性疼痛、闭经、流产等，是导致女性不孕的主要原因之一 。一般来说，子宫内膜在雌激素的作用下会周期性脱落，这种生理状态下的子宫内膜创面会得到修复，不会引起 IUA。但宫腔内手术，如人工流产、剖宫产、清宫术等，会造成子宫内膜严重损伤，导致长期持续的炎症。而长期的炎症会促进纤维蛋白原的转化，从而形成纤维蛋白，导致细胞外基质（ECM）过度沉积形成 IUA。临床上，宫腔镜检查是诊断粘连的常用方法，通常在出现 IUA 及相关并发症的患者中进行。然而，鉴于存在原发性或复发性粘连，该过程似乎相当复杂。此外，由于宫腔镜手术会造成新的伤口，因此粘连松解术后子宫再次粘连的情况仍然比较常见。鉴于 IUA 及相关疾病的高发病率，迫切需要一种安全高效的防粘连材料来有效预防 IUA 和复发性粘连。 纤维蛋白和成纤维细胞的过度沉积被认为是 IUA 的根本原因。 然而，很少有临床策略能有效防止细胞外基质（ECM）在子宫内膜伤口处沉积，其中包括蛋白质和细胞沉积。
来自中国科学院大学的陈强团队、来自温州医科大学附属平阳县人民医院的Bujun Wang团队和来自温州医科大学附属第一医院的Feng Lin团队合作采用可注射的颗粒状聚（N-（2-羟乙基）丙烯酰胺）（PHEAA）水凝胶（颗粒状 PHEAA 凝胶）来预防术后 IUA，这种凝胶具有出色的防污特性，能显著减少蛋白质和细胞粘附 。具有堵塞网络结构的颗粒状 PHEAA 凝胶具有出色的注射性和卓越的稳定性。与 IUA 组相比，颗粒状 PHEAA 凝胶可促进子宫内膜的再生，同时减少子宫内膜纤维化的面积。免疫组化染色实验表明，颗粒状 PHEAA 凝胶能改善 IUA 大鼠子宫内膜的增殖，促进血管生成，增强抗炎效果。颗粒状 PHEAA 凝胶还能有效减缓子宫组织的纤维化。重要的是，注射颗粒状 PHEAA 凝胶后，胚胎数量明显增加，由此推断受伤的子宫内膜有明显的生殖功能恢复。相关工作以题为“Antifouling and Injectable Granular Hydrogel for the Prevention of Postoperative Intrauterine Adhesion”的文章发表在2023年9月18日的国际著名期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》。
1. 创新型研究内容
如图 1 所示，为了 制备 PHEAA 块状水凝胶 ，本研究将一系列浓度的 HEAA 单体（30%、40% 和 50%）溶解于去离子水中，在 Irgacure 2959 的存在下进行脱气，在紫外光下光聚合后自交联，从而形成物理交联水凝胶，整个过程无需任何化学交联剂。基于氢键相互作用的 PHEAA 水凝胶自交联在之前的报道中已有大量研究。在去离子水中实现完全溶胀平衡后，将块状水凝胶冷冻干燥，然后彻底研磨成凝胶颗粒。磨碎的凝胶颗粒再经 150 目筛网筛选，得到凝胶微粒。最后，这些微粒在水中重新膨胀并卡在一起，形成颗粒状 PHEAA 水凝胶。本研究的 颗粒状 PHEAA 凝胶是可注射的 ，可以很容易地用针头注射。如图 1b 所示，颗粒状 PHEAA 凝胶的形成受凝胶微粒浓度的显著影响。当凝胶微粒浓度为 20 毫克/毫升时，它表现出类似液体的特性，而当浓度为 40 毫克/毫升时，它在被针挤压后仍能保持形状，这意味着它表现出类似固体的特性。当颗粒浓度较低时（如图 1b 中的 20 毫克/毫升），凝胶颗粒之间没有接触或接触不紧密。当颗粒浓度增加时（如 40 毫克/毫升），颗粒间的紧密堆积导致外力引起的变形和摩擦力的增加，使凝胶颗粒保持卡住结构。光学显微镜可以验证本研究制备的颗粒状 PHEAA 凝胶的挤压结构。从图 1c 中可以明显看出，颗粒状 PHEAA 凝胶中不规则的微凝胶被紧密地挤压在一起。颗粒状凝胶经冷冻干燥后，可通过扫描电子显微镜（SEM）检测到多孔结构的支架，如图 1d、e 所示。
图1 颗粒状 PHEAA 水凝胶示意图
本研究结果表明： 单体浓度越高，膨胀率越低 。这表明单体浓度越高，PHEAA 块体凝胶中的交联越密集。图 2 展示了 GPHEAA XX-40 的流变特性，其中凝胶由不同单体浓度（30、40 和 50 wt %）和相同的凝胶颗粒浓度（40 mg/mL）组成。图 2a 中的频率扫描显示，在测试范围（0.1-100 rad/s）内，GPHEAA XX-40 的 G′和 G″ 值均随频率的增加而增加，且 G′ 值始终大于 G″，这表明 凝胶表现出类似固体的行为 。然而，颗粒状 PHEAA 凝胶的 G′和 G″ 值并没有随着 HEAA 单体重量百分比的增加而发生显著变化，这表明在块状 PHEAA 水凝胶中增加 HEAA 单体并不能改善颗粒状 PHEAA 凝胶的机械性能。图 2b 显示了以 10 rad/s的固定频率在 0.1%-1000% 的应变范围内进行的应变扫描测试。结果发现，在屈服应变处有一个交叉点，当剪切应变小于屈服应变时，G′大于G″，而当剪切应变大于屈服应变时，G′被*翻推**。这些现象表明存在凝胶向溶液的转变行为，颗粒状 PHEAA 凝胶在小剪切应变时表现为固态，而在大应变时则表现为液态。此外，如图 2c 所示，随着 HEAA 单体重量百分比的增加，颗粒凝胶的 G′和 G″ 交叉点处的屈服应变值显著增加，三种颗粒凝胶的屈服应变均大于 10%。值得注意的是，据报道人体组织所承受的最高应变小于 10%，这表明本研究的颗粒状 PHEAA 凝胶在体外环境中能保持其类似固体的特性，从而 更好地达到防粘连的目的 。根据 GPHEAA XX-40 凝胶的流变测试结果，HEAA 单体的重量百分比定为 40 wt %。
图2 粒状 PHEAA 凝胶的流变特性
本研究进一步关注了 GPHEAA 40-40 的可注射性和稳定性 。如图 3a 所示，本研究对 GPHEAA 40-40 进行了温度扫描。考虑到正常人的体温恒定在 37 ℃ 左右，本研究在 35-45 ℃ 范围内进行了温度扫描。随着温度的升高，GPHEAA 40-40 的 G′和 G″ 略有下降，这可能是由于颗粒凝胶中的 H 键减弱所致。当温度降至 35 ℃，随着颗粒凝胶中 H 键的重组，G′和 G″ 恢复到原来的值。值得注意的是，经过五次温度扫描后，GPHEAA 40-40 的 G′和 G″在上升和下降过程中仍保持初始水平，且 G′始终高于 G″，显示出 类似固体的特性 。随后，本研究测试了 GPHEAA 40-40 的阶跃应变扫描曲线（图 3b）。在 100% 的高剪切应变下，GPHEAA 40-40 表现出 类似液体的特性 ，而在切换到 0.01% 的低剪切应变后，GPHEAA 40-40 又能立即恢复到原来的水平，这表明 GPHEAA 40-40 能够重新建立氢键相互作用， 有利于注射后颗粒凝胶的快速重建 。此外，本研究还进一步测量了 GPHEAA 40-40 在剪切力作用下的粘度。在图 3c 中，本研究发现颗粒凝胶的粘度从 0.01 s-1 时的∼103 Pa·s 急剧下降到 1000 s-1 时的 3 × 10-1 Pa·s，而在剪切速率为 0.01 s-1 时，粘度又上升到原来的水平。在振荡条件下，每个剪切速率下的粘度都相对稳定。此外，本研究还测试了 GPHEAA 40-40 储存 3 天后的粘度，发现其剪切稀化特性与原来的粘度没有显著差异，这表明 GPHEAA 40-40 在长时间储存后仍具有最初的可注射性 。这些现象还确定了 GPHEAA 40-40 稳定的剪切稀化特性，有利于在通过针头挤出后在组织表面保持类似固体的形状。这些结果表明， 本研究的颗粒状 PHEAA 凝胶具有出色的可注射性和卓越的稳定性 。
图3 颗粒状 PHEAA 凝胶的稳定性和注射性
据报道， 蛋白质吸附和成纤维细胞粘附是导致腹腔内受损表面与后续粘附发展之间建立联系的关键步骤 。在接下来的实验中，本研究以荧光 BSA（FITC-BSA）为模型，测试了 PHEAA 凝胶对蛋白质的吸附情况，如图 4a-c 所示。与 TCPS 相比，PHEAA 凝胶表面对荧光 BSA 的吸附量很小。凝胶的吸附率为 2.37%（以对照组的 TCPS 为 100%），表明凝胶表面几乎没有吸附 BSA。同样，荧光纤维蛋白原在凝胶上的吸附率为 0.59%（图 4d-4f），表明 PHEAA 块状凝胶表面几乎没有吸附纤维蛋白原。这一结果归因于 PHEAA 凝胶的防污特性，而防污特性则归因于 PHEAA 链的强大水合能力。除了低蛋白质吸附特性外，凝胶还表现出低细胞粘附特性。如图 4g-4i 所示，在 TCPS（作为对照组）上观察到大量粘附的 L929 细胞，其数量约为 2.1 × 104 cells/cm2（图 4i），但在 PHEAA 块状水凝胶表面几乎观察不到这些细胞。与 TCPS 相比，颗粒状 PHEAA 凝胶对 BSA 和纤维蛋白原的吸附率分别为 13.95% 和 24.69%（对照组 TCPS 为 100%）。L929 细胞粘附在 TCPS 和颗粒 PHEAA 凝胶上的光学显微镜图像显示了细胞与 PHEAA 微凝胶之间的分离。结果表明，颗粒状 PHEAA 凝胶与块状 PHEAA 凝胶具有相同的防污性能。 低蛋白吸附和无细胞粘附表明 PHEAA 水凝胶具有良好的防污能力，有可能阻止纤维蛋白原和成纤细胞的粘附。
图4 FITC-BSA 吸附的荧光显微镜图像
由于本研究的颗粒状 PHEAA 凝胶具有出色的可注射性和防污特性，因此 有望成为有效防止 IUA 的防粘连屏障 。将颗粒状 PHEAA 凝胶（即 GPHEAA 40-40）注入 SD 大鼠的子宫腔以评估其恢复情况。假手术组子宫表面呈淡粉红色，伸展性良好，双侧子宫长度相等，厚度均匀（图 5）。而 IUA 组的子宫薄、僵硬、弹性下降（图 5b）。与 IUA 组相比，颗粒状 PHEAA 凝胶组的子宫弹性更高，厚度更均匀（图 5c），形状与假体组相似。更重要的是， 使用颗粒状 PHEAA 凝胶恢的复后的子宫内膜表面瘢痕较少 。
图5 不同组别受伤子宫的形态和超声检测
14 天后子宫样本的苏木精-伊红染色结果如图 6所示。 为评估受损子宫内膜的纤维化情况 ，本研究采用 Masson 染色法测量子宫内膜纤维化面积的比率（图 6b）。在假手术组中，子宫内膜表面衬有简单的高柱稀疏上皮细胞（图 6a）。圆形或椭圆形腺体主要出现在粘膜下层和基底层。子宫内膜刮除 14 天后，IUA 组的子宫内膜表面几乎被低柱状上皮细胞覆盖，并可检测到宫腔粘连。在光镜下观察和测量子宫内膜的厚度和形态。在高倍镜下随机选取 5 个视野，分别计数每个 HE 染色切片上的腺体数量，并计算平均值。使用定量图像分析系统（Image-Pro Plus 软件；Media Cybernetics, Bethesda, MD）在 200 倍放大镜下测量子宫内膜基质纤维化与子宫内膜面积的面积比，从而量化子宫内膜纤维化的程度。与 IUA 组相比，颗粒状 PHEAA 凝胶干预后，大鼠子宫内膜的腺体数量和内膜厚度均有所增加（P < 0.05，图 6c，d）。从图 6b 可以发现，与假手术组相比，IUA 组的子宫内膜纤维化面积比明显增加。然而， 当 IUA 大鼠接受颗粒状 PHEAA 凝胶治疗时，子宫内膜纤维化程度明显降低 （图 6e）。
图6 不同组子宫的组织学结构
为了 评估颗粒状 PHEAA 凝胶处理对子宫内膜再生的影响 ，本研究评估了 Ki67（一种细胞增殖各阶段的核抗原）的表达，以评价颗粒状 PHEAA 凝胶是否能促进子宫内膜细胞的增殖。如图 7所示，IUA 组检测到的增殖细胞数量较少或没有。但颗粒状 PHEAA 凝胶组上皮细胞 Ki67 浓度明显增加（图 7b）。vWF 是一种著名的血管生成因子，与血管的形成呈正相关。有证据表明，vWF 还具有抗细胞凋亡和血管重塑等其他功能。为了探索 vWF 可能参与子宫内膜修复的情况，本研究通过免疫组化染色估算了 vWF 的数量（图 7a）。结果显示，IUA 组的 vWF 水平明显下降，但颗粒 PHEAA 凝胶组的 vWF 水平明显升高（图 7c）。
图7 Ki67、TGF-β 和 vWF 的免疫组织化学染色
为了 评估颗粒状 PHEAA 凝胶治疗 IUA 大鼠后的功能改善情况 ，本研究将雌性大鼠进行了交配，妊娠结果如图 8 所示。干预 IUA 60 天后，我们发现 IUA 组的部分子宫没有胚胎着床，而对照组和颗粒 PHEAA 凝胶组的所有子宫都有胚胎着床，并发育到妊娠晚期。此外，IUA 组的胚胎数量明显减少，而使用颗粒状 PHEAA 凝胶处理的胚胎数量则显著增加（图 8b-8d）。这些结果表明， 原位注射颗粒状 PHEAA 凝胶可明显恢复损伤子宫内膜的生殖功能 。
图8 IUA大鼠子宫损伤的生殖功能
2. 总结与展望
总之，本研究 设计了可注射和防污的颗粒状 PHEAA 凝胶，以防止术后 IUA 。颗粒状 PHEAA 凝胶是由冻干的 PHEAA 凝胶微粒在水中溶胀合成的，其中 PHEAA 水凝胶通过氢键自交联。因此，颗粒状 PHEAA 凝胶是一种卡合型水凝胶， 具有出色的注射性和卓越的稳定性 。与 IUA 组相比，颗粒状 PHEAA 凝胶改善了子宫内膜的再生，使腺体数量增加，子宫内膜增厚，子宫内膜坏死面积缩小。研究还发现，IUA 大鼠子宫内膜免疫组化染色中 Ki67 和 vWF 的表达上调，推断本研究的颗粒状 PHEAA 凝胶增加了子宫内膜的增殖并促进了血管的形成。有趣的是，TGF-β变得更低，表明IUA大鼠的炎症反应也更弱，这可能与PHEAA凝胶的防污特性有关。以上结果表明，颗粒状PHEAA凝胶能有效抑制子宫组织的坏死，预防术后IUA的发生。本研究还对损伤子宫内膜的恢复情况进行了生殖功能评估，发现注射颗粒状PHEAA凝胶后胚胎数量明显增加，由此推断生殖功能有明显的恢复。本研究相信， 这种可注射、防污的颗粒状水凝胶将成为有效预防术后IUA的新候选材料 。
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