实时荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）是一项以 PCR 反应为基础的 DNA定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基因的定性和定量分析。现有两种常用的方法对 PCR 产物进行荧光定量：一种是利用荧光染料与双链 DNA 结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA 探针对目标基因进行定量。
基本原理
我们知道理想状态下的PCR是一变二、二变四、四变八的一个等比增长过程，但理论上来说并不是每次都会100%的底物都参与反应，因此会存在一个扩增效率值。例如有90%的底物参与了扩增反应，扩增效率为0.9。如图：
图1 理想状态PCR循环数及产物
但由于在实际反应体系当中酶、buffer等都是有限的，反应并不能一直无限地进行下去。因此实际的反应情况如下图：
图2实际反应体系及产物
（1）指数期：刚开始反应的时候，酶、缓冲液、能量、dNTP等都是充足的，这时候PCR按照理论情况扩增，限速因子为底物的量；
（2）线性期：随着时间的增加，产物越来越多，每次循环所需要的酶也就越来越多，当体系中所有的酶都开始参与扩增反应后，每个循环扩增得到的产物数就是恒定的，开始和循环数呈线性关系，此时限速因子变为酶的量；
（3）衰退期：随着反应进行时间越来越长，酶逐渐开始失活，dNTP逐渐消耗殆尽，产物增加量逐渐减少；
（4）平台期：反应结束，产物不再增加。
荧光定量PCR是使用荧光标记PCR产物后，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
荧光定量PCR的过程包括以下几个关键步骤：
1. 引物和探针的设计：根据目标DNA序列设计特异性引物和荧光标记的探针。探针通常含有一个荧光报告基团和一个猝灭基团，当探针完整时，荧光被猝灭。
2. PCR扩增：在PCR反应中，每经过一个循环，目标DNA序列被复制一次，同时荧光标记的探针与目标序列结合。一旦探针与目标序列结合，DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性会切断探针，释放荧光报告基团，从而产生荧光信号。
3. 荧光信号的检测：随着PCR反应的进行，PCR产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
4. 数据分析：通过荧光扩增曲线图，可以确定目标DNA的起始拷贝数。目标核酸的起始拷贝数越高，荧光的显著增加就会越快观察到。
5. 标准曲线：使用已知浓度的标准品制作标准曲线，通过比较样品的荧光信号与标准曲线的关系，可以计算出未知样品中目标DNA的准确浓度。
总的来说，荧光定量PCR是一种快速、准确、灵敏的核酸定量技术，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传变异分析等领域。通过实时监测PCR过程中的荧光信号变化，可以实现对目标基因的定量分析，而无需进行繁琐的后处理步骤。
图3 相对荧光与循环数
重要的概念
实时荧光定量PCR技术中有几个重要的概念，包括扩增曲线、基线、荧光阈值和域值循环数。
（1）扩增曲线（amplification curve）: 是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号随着循环数变化而绘制的一条曲线。在进行PCR反应过程中，通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测，最后将荧光信号值通过成像技术显现在计算机上。正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。
（2）基线（baseline）：是背景曲线的一段，在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大，接近一条直线。
（3）荧光阈值（threshold）:是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准）。荧光阈值可以设定在PCR扩增的指数期。
（4）阈值循环数:表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数，研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小;起始拷贝数越少,CT值越大。我们利用已知起始拷贝数的标准品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标,CT值为纵坐标的一条标准曲线。只要获得未知模板的CT值,即从标准曲线上计算出该模板的起始拷贝数。
qPCR的类型
qPCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。而qPCR的方法相应的可分为特异类和非特异类两类，特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物；而非特异性检测方法是在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
荧光染料嵌合法
一种最为常用的定量方法就是在 PCR 反应体系中加入荧光染料，此类荧光染料会与所有的双链 DNA 结合，并产生荧光。游离的荧光分子不会产生荧光信号，只有与双链 DNA结合的荧光分子才会释放荧光，随着 DNA 拷贝数的增加，测得的荧光强度也会增强。
图4 荧光染料嵌合法
利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉，只需要一对普通的引物就能完成定量。然而，常用的诸如 SYBR Green 染料会与所有的双链 DNA 无差别地结合，包括引物二聚体，因此有可能会导致对目标基因的定量不精确，灵敏度偏低。
非特异性染料（荧光染料嵌合法）：
①SYBR Green I，非饱和荧光染料，不会与dsDNA上所有可结合位点结合；
②Eva Green，饱和荧光染料，可以与dsDNA上所有可结合位点结合。
荧光探针法
荧光探针只能检测出与自身序列互补的 DNA 片段，因此用探针法定量可以有效地避免引物二聚体的干扰，使定量结果更加精确。此外，通过使用携带不同荧光信号的多种探针，我们可以同时对一个样品中的多个靶序列进行定量。荧光探针的 5’端携带有一个荧光报告基团，3’端则为淬灭基团，在正常情况下两个
基团间的距离很近，淬灭基团会抑制报告基团使其无法发出荧光。在 PCR 反应过程中，引
物和荧光探针在退火阶段都会与目的片段结合；在延伸阶段，Taq 酶因为具有 5’-3’核酸外切酶活性，会将探针，使得报告基团和淬灭基团相互分开，从而释放出荧光。每增加一条目的基因的拷贝，就会有一个探针被切开并释放荧光信号，因此随着 PCR 反应的进行，荧光信号会逐渐增强。
特异性染料（荧光探针法）：
①水解型的探针：如TaqMan
②杂交型的探针：如分子信标
③Dual-oligo FRET探针（双杂交探针）
图5 荧光探针法
使用探针进行荧光定量的优点就是精确度和灵敏度都要比荧光染料高，且可以做到同时对多个基因进行定量，但是相应的合成探针的成本也要比使用荧光染料高出许多。
表1 SYBR Green燃料法 VS TaqMan探针法
应 用
荧光定量PCR技术的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：
- 基因表达分析：通过测量特定mRNA的量，可以研究不同条件下基因的表达水平。这对于理解基因功能和调控网络至关重要。
- DNA拷贝数检测：荧光定量PCR可以用来确定基因组*特中**定DNA序列的拷贝数，这对于诊断某些遗传病和癌症相关基因变异非常重要。
- 单核苷酸多态性（SNPs）测定：SNPs是基因组中的单个核苷酸变化，它们与多种遗传性疾病有关。荧光定量PCR可以用于快速检测这些变化。
- 病原体检测：在医学诊断中，荧光定量PCR常用于检测病毒、细菌等病原体的存在和数量，如HIV、肝炎病毒等。
- 肿瘤标志物分析：荧光定量PCR可用于监测肿瘤标志物的表达，帮助评估肿瘤的发展和治疗效果。
- 药物耐受性分析：在癌症治疗中，荧光定量PCR可以用来检测肿瘤细胞对某些药物的耐受性，从而指导治疗方案的选择。
此外，荧光定量PCR还被应用于环境监测、食品安全检测等领域。例如，可以通过检测食品中的微生物DNA来判断食品是否受到污染。在环境科学中，荧光定量PCR用于监测环境中的微生物群落和污染物质。
总的来说，荧光定量PCR因其高灵敏度、高特异性和实时监测能力，已成为生命科学研究和临床诊断中不可或缺的工具。
