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2016年,Tuschl等报道了以严重锰蓄积为病理特征并伴随儿童期发作的帕金森综合征-肌张力障碍的新型的常染色体隐性遗传病。他们通过外显子测序发现这些患者的SLC39A14基因存在纯合突变。患儿发育停滞,血锰水平比正常人高出3~25倍,血液中铁、锌、镉的水平正常;中枢神经系统锰蓄积并出现严重的全身性肌张力障碍,四肢挛缩、脊柱侧弯,丧失独立行走的能力;有些患者表现出帕金森综合征的特征,如低血压、震颤、运动迟缓。

但是患儿并没有像SLC30A10突变患者出现肝脏锰蓄积和肝脏疾病,他们认为SLC39A14可能在肝脏锰代谢过程中发挥重要作用,可能通过调节肝脏锰吸收进而维持全身锰稳态。Tuschl等和本团队分别用斑马鱼模型和基因敲除小鼠模型证实了这一猜想,揭示了SLC39A14功能缺陷会影响肝脏吸收锰离子,伴发全身锰蓄积,引发系列病理损伤。

虽然SLC39A14在肝脏以及神经元中均有表达,但SLC39A14突变的患儿的脑中有锰蓄积而在肝组织中却没有,提示SLC39A14对神经元细胞摄取锰不是必需的。SLC30A10促进肝脏排泄锰,而SLC39A14促进肝脏吸收锰,SLC30A10、SLC39A14突变都表现出严重的锰蓄积。不同的组织器官可能存在各自特殊的锰转运机制,这些转运蛋白调控锰稳态机制尚需深入探讨。组织特异性基因敲除小鼠是探索这些问题的不可替代的研究模型。

以锰缺乏为病理特征的人类疾病

2015年,Park等和Boycott等分别报道了SLC39A8突变引起的锰代谢异常遗传病。Park等通过外显子测序和糖基化分析发现,患者SLC39A8基因存在纯合突变,导致表达产物携带甘氨酸至精氨酸的突变及异亮氨酸至天冬酰胺的突变。SLC39A8突变患者的血锰水平下降;锰依赖性酶活性降低,主要是β-1,4-半乳糖基转移酶;并表现出小脑萎缩、智力障碍、侏儒症、颅骨不对称和听力损失等症状。这是首次发现具有遗传性糖基化障碍的微量元素缺乏症。

SLC39A8调控全身锰稳态,是锰中毒的潜在治疗靶点。未来的研究需要确定SLC39A8致病突变引发人类遗传病的精细分子机制。

锰转运蛋白研究的模式生物模型

微量元素对维持生物体代谢和健康至关重要,其稳态失衡会造成代谢异常,甚至死亡。生物体存在复杂机制维持这些微量元素的稳态代谢平衡。酵母作为优秀的生物模型在真核生物锰离子转运机制的研究中发挥着重要作用;但是高等生物体内锰离子稳态调控机制复杂,酵母模型仍存在局限性。脊椎动物模型对揭示高等生物体内锰离子稳态代谢发挥不可替代的作用;斑马鱼模型和基因敲除小鼠为研究金属离子代谢调控机制、相关疾病的发病机理以及药物研发提供了理想的动物模型。

酵母在锰转运蛋白研究中的作用

酵母是单细胞的真核生物,约有6000个基因;1996年酵母全基因组测序完成后发现,其功能基因约40%含有与人类基因相似的保守序列。其中,酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是探索真核生物锰离子转运机制的主要模型。经过多年的研究,酵母中简单的锰离子代谢通路已基本建立。锰离子主要通过酵母细胞膜上的Smf1、Smf2进入细胞,分别被Pmr1p和Smf2转运至高尔基体和线粒体,被糖基转移酶及MnSOD利用,最后通过囊泡排出多余的锰离子。酵母内锰离子转运蛋白已被鉴定,这为高等生物包括人类的锰离子转运机制研究提供了重要思路。

slc30a10突变斑马鱼模型

本团队运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术成功构建了slc30a10突变的斑马鱼模型。成年突变体表现出显著的体内高锰和运动障碍,胚胎突变体在暴露于高锰的条件下出现脑和肝脏的锰蓄积,为研究SLC30A10突变提供了很好的模型。对该模型研究发现,锰蓄积可损害γ-氨基丁酸和多巴胺信号传递,为该病中枢神经系统障碍可能的机制提供理论依据。此外,用EDTA-CaNa2螯合疗法以及富马酸亚铁可缓解突变斑马鱼的高锰血症。该研究还提出atp2c1在调节锰代谢方面可能具有补偿作用的分子机制。

Slc30a10基因敲除小鼠模型

Steven等运用Cre-loxp技术构建了Slc30a10基因全身敲除小鼠模型(Slc30a10-/-)。全敲小鼠表现出生长迟缓,并在6~8周龄出现过早死亡;6周龄时,脑、血液和肝脏中的锰含量比对照组高约20~60倍。低锰饮食可以降低Slc30a10-/-小鼠体内的锰水平进而缓解其症状,表明锰毒性是潜在的致病原因。

继之,Steven等还构建了Slc39a14和Slc30a10双敲小鼠模型。该模型血、脑锰水平比单敲小鼠模型更高,验证了Slc39a14和Slc30a10在肝脏吸收排泄锰的过程中可能具有协同作用。与单敲模型相比,双敲模型更具有创新性,对不同基因之间相互作用的研究具有重要意义,为未来的研究提供了一种重要的思路。

Tuschl等在发现了人类SLC39A14的纯合突变导致新型的以锰蓄积为主要病理改变的遗传病后,为了进一步阐明SLC39A14在锰稳态中的作用,他们通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建了slc39a14缺陷的斑马鱼模型。slc39a14突变的斑马鱼出现锰蓄积并伴随运动功能障碍,而铁、锌及镉的水平并未明显变化。该模型很好地模拟了SLC39A14突变的患者的病理特征,证实SLC39A14对维持机体锰稳态具有重要的作用。这将有助于进一步阐明锰毒性的机制,为锰毒性相关的神经退行性疾病的药物开发提供新的途径。

本团队利用Slc39a14全身敲除(Slc39a14-/-)小鼠及肝细胞特异性敲除(Slc39a14fl/fl;Alb-Cre+)小鼠模型展开了深入研究。Slc39a14全敲小鼠的脑组织及其他肝外组织锰水平显著增加,并伴随神经运动障碍;锌、铁及铜离子水平未见显著变化。该小鼠模型较好地模拟了SLC39A14突变的患儿神经运动行为以及锰代谢异常的特征改变。

Slc39a14全身敲除引发小鼠神经运动障碍的表型以及锰离子的多脏器蓄积,也被另外两个团队的独立研究得到充分的证实。为了进一步验证Slc39a14在肝脏锰代谢的功能,本团队用高锰饲料饲喂Slc39a14肝实质细胞特异性敲除小鼠。与对照小鼠比较,肝敲小鼠的脑组织、血清和其他肝外组织中锰水平明显升高,但肝脏锰水平没有明显变化,提示Slc39a14在肝实质细胞吸收锰离子的重要作用。但肝实质细胞Slc39a14突变并没有引发全身高锰,进一步提示Tuschl等提出的人类SLC39A14突变导致肝脏胆管锰离子外排障碍的致病理论是不准确的。

Aydemir等通过皮下注射放射性54Mn的方式干预Slc39a14全敲小鼠,发现脑、血液中54Mn显著升高,而肠上皮和肠腔内放射性54Mn的含量低于对照组,他们提出血液中多余的锰可能通过定位于小肠基底膜的Slc39a14吸收入小肠上皮,随着小肠上皮的新陈代谢或者在转运蛋白的协助下排入肠腔,随粪便排出体外。由于该研究使用的是Slc39a14全身敲除小鼠模型,尚不能清晰地解析肝肠锰离子的外排机制,但该研究为机体锰稳态的调控提供了新的思路。

Lin等运用Cre-loxp技术构建了诱导型Slc39a8的全身敲除小鼠(ZIP8-iKO)和Slc39a8肝特异性敲除小鼠(ZIP8-LSKO)模型。全敲和肝敲小鼠肝脏、肾脏、脑组织、心脏以及全血的锰水平均显著降低,而锌和铁的水平与对照组相比没有显著差异。他们将携带表达人源SLC39A8的腺相关病毒载体注入肝敲小鼠后,小鼠的肝脏中可表达人SLC39A8蛋白并且组织和血锰水平增加。运用免疫荧光的技术分析证实Slc39a8定位于肝细胞胆管侧细胞膜,推测Slc39a8可能通过从胆汁中重吸收锰来调节全身锰稳态,进而调节锰依赖性精氨酸酶和β-1,4-半乳糖基转移酶的活性。

Dmt1突变的动物模型为研究DMT1的生理作用发挥了重要作用。小细胞贫血(microcyticanemia,mk)小鼠和Belgrade大鼠均表现为常染色体隐性遗传的小细胞贫血，其Dmt1基因分别携带G158R和G185R的突变,该突变影响Dmt1的定位和功能,导致小肠和网织红细胞吸收铁的效率均下降,证明了Dmt1在铁转运中的作用。Chua和Morgan发现Belgrade大鼠十二指肠吸收锰的能力下降;而Shawki等用肠道特异性Dmt1敲除小鼠研究表明,肠道Dmt1敲除并不影响小鼠体内Mn的吸收及组织分布,但在锰过度暴露或者铁缺乏的时候可能参与锰的吸收。DMT1在锰代谢中的作用尚存在争议。

遗传性低转铁蛋白血症(hypotransferrinemia,Tf hpx/hpx,或称为Hpx)小鼠Tf基因16号外显子后带有一个突变,导致TfmRNA剪切错误,翻译出短的Tf。Tf hpx/hpx小鼠表现为严重的贫血并伴随肝铁蓄积,同时体内铁调素(hepcidin)很低。Herrera等用Tf hpx/hpx小鼠研究Tf对铁、锰、铜、锌分布的影响发现,在对照组小鼠血清中检测到与Tf结合的铁和锰,未检测到与Tf结合的铜、锌,提示锰和铁存在共同的Tf转运机制,然而与Tf结合的锰比Tf结合的铁低两个数量级,Tf在锰代谢中的作用尚需更有力的实验模型和人群数据。

Fpn全身敲除的纯合小鼠表现出胚胎致死,杂合小鼠不表现铁蓄积的表型。组织特异性敲除的Fpn小鼠模型为阐明其功能和机制提供了关键数据,如具有严重的缺铁性贫血表型的小肠上皮细胞特异性敲除模型、巨噬细胞特异敲除小鼠、肝实质细胞特异敲除小鼠以及巨噬细胞和肝实质细胞双敲小鼠模型等,这些模型在揭示铁稳态调控机制上发挥了重要作用。

Flatiron小鼠的Slc40a1携带H32R位点突变,影响Fpn的定位和铁外排的能力,具有与4型血色病患者相似的表型,为Slc40a1功能缺失性突变提供了很好的模型。2015年,Seo和Wessling-Resnick发现Flatiron小鼠小肠54Mn吸收、血锰、红细胞MnSOD活性下降,提示Fpn除了作为铁的重要外排蛋白,在肠道锰吸收中也发挥重要作用。Flatiron小鼠为锰稳态代谢的研究提供了一个较好的模型。

锰离子作为人体必需微量元素,人类对其功能及代谢还知之甚少。锰离子转运蛋白的发现要更多地归功于人类遗传性疾病研究的发展,也开启了人类探索锰代谢的新历程。目前,虽然对这些转运蛋白的转运功能有了初步的理解,但转运蛋白突变致病及其精细的调控机制还存在诸多未知,特别是多个膜蛋白是否真正转运锰离子还存在较大的争议。模式动物,包括斑马鱼突变模型或组织特异性基因敲除小鼠模型,将为探索锰转运蛋白功能、突变致病分子机制、新药研发等提供重要的实验工具。先进的动物模型结合人群流行病学更是锰代谢领域的重要研究方向。可以乐观地憧憬,人们将掀起新一轮的锰代谢研究高潮,锰代谢机制与人类重大疾病防控将在未来的五年内有突飞猛进的重大突破。