作者︱胡彬彬 谭子璇 罗妙玲 邓孝阳 张文潇 来源︱Bio-protocol第三届生物实验短视频大赛
原代细胞分离培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。获得高纯度、高活性的原代细胞是很多细胞实验成功的关键要素之一。
肾脏疾病是一种普遍的疾病，其种类繁多，且患病率逐年升高，是一类严重危害人类健康的疾病 。近端肾小管上皮细胞作为构成近端小管的重要细胞组分之一，与水、葡萄糖、氨基酸及药物的代谢密切相关，是研究急性肾损伤、慢性肾病、糖尿病肾病、肾间质纤维化等肾脏疾病的重要载体和工具细胞。目前许多研究的体外实验主要使用肾小管细胞株，但细胞株存在部分基因变异或缺失的情况，与机体正常细胞的性状差异较大，相较而言，原代肾小管上皮细胞更能够反映细胞的生理状态 。使用小鼠模型，通过体外实验从这些肾脏中分离近端肾小管上皮细胞对进一步研究肾脏疾病的致病机制有重要意义。 本视频分享小鼠近端肾小管上皮细胞分离的方法，得到一种实用的体外细胞模型。
一、实验材料与试剂仪器
1. 样品信息
3-4周龄C57/BL6雄性小鼠
2. 试剂和耗材
手术用具，75%酒精 500 mL，PBS,小皿，六孔板，蓝枪头，胶原酶，无菌吸管，15 mL离心管，50 mL离心管，完全培养基（含10% FBS）\1640，DMEM/F-12，滤头，针管，筛网
3. 仪器和软件
旋转混匀器，5%二氧化碳培养箱
二、实验操作
小鼠近端肾小管上皮细胞分离
该作品在Bio-protocol第三届生物实验短视频大赛中荣获优秀奖，欢迎访问网站查看原视频: https://s.bio-protocol.org/e9ed3a3344739feb
1.将3-4周龄C57/BL6雄性小鼠引颈处死，75%酒精浸泡消毒5-10 min。
2.沿背部双肾区剪开，无菌获取双肾，置于装有预冷的PBS的培养皿中，反复冲洗双肾。去除肾包膜和肾蒂组织。
3.将肾脏皮质与髓质分离，留下肾皮质在培养皿中用组织剪充分剪碎，并与低糖DMEM（DF-12）混合后移入离心管中，1500 r/min 离心5 min。
4.去除离心管中的上清液，加入8 mL II 型胶原酶(1 mg/mL; Worthington Chemical, Lakewood NJ)溶液至离心管中( 0.1% g/mL)，即称取0.01 g II 型胶原酶加入10 mL PBS(DF-12)中，然后用0.22 μM滤器过滤)，反复吹打数次，将离心管放置于旋转混匀器（70 rpm）上37 °C消化20 min。
5.用无菌吸管将混悬液反复吹打数次后，取70 μm和40 μm的筛网，双重过滤细胞，去除未消化的肾组织（可再加一些培养基将未滤过点细胞流下）。
6.向过滤后的细胞悬液中加入37 °C预热的完全培养基（含10% FBS）\1640培养基终止消化。加入与胶原酶等量培养基终止消化
7.将上述细胞悬液150 ×g （200 r）离心10 min,去除上清液，在离心管的细胞沉淀中加入提前在37 °C 预热的DMEM/F-12培养基，反复吹打数次使细胞重悬。接种到25 cm2培养瓶后置入37 °C、5% CO2培养箱内，12 h 内不宜晃动培养瓶。48 h 后首次更换培养基，此后隔天更换1次。
三、注意事项
1. 尽量保证无菌操作，防止原代细胞被污染
2. 操作难点为肾脏皮质和髓质分离（两种方法:去除髓质和剪取皮质），需多加练习
3. 操作原代细胞时动作应轻柔，放入培养箱后12 h不宜晃动
四、作者及单位简介
作者简介
胡彬彬、张文潇 湖南师范大学医学院临床医学本科生
罗妙玲、邓孝阳 湖南师范大学生命科学学院生物科学本科生
技术指导：谭子璇 湖南师范大学生命科学学院生理学研究生
课题组简介
朱武政课题组主要研究方向为：线粒体功能障碍与急性肾损伤（AKI）、糖尿病心血管相关疾病的机制研究及其靶向治疗。主要研究线粒体损伤在AKI、心血管疾病发生发展中的病理生理作用及机制，并探索运用小分子天然化合物以及干细胞治疗对相关疾病进行改善和治疗。近年来，在 Cell Death & Disease ， British Journal of Pharmacology ， Clinical Science 等杂志上发表多篇SCI论文，主持国家自然科学基金以及省部级等多项基金。
单位简介
湖南师范大学生命科学学院动物营养与人体健康实验室是由印遇龙院士领衔组建的重点实验室，本实验室主要围绕营养、代谢与动物及人体健康展开一系列相关研究。
五、参考文献
[1] 王梨名,陈佳,陈客宏,蔡明玉,汪晓月,何娅妮.小鼠近端肾小管上皮细胞原代培养及鉴定[J].生理学报,2018,70(04):406-412.DOI:10.13294/j.aps.2018.0046.
[2] Terryn S, Jouret F, Vandenabeele F, Smolders I, Moreels M, Devuyst O, Steels P, Van Kerkhove E. Aprimary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes. Am J Physiol Renal Physiol 2007; 293(2): F476–F485.
Bio-protocol 简介
Bio-protocol于2011年在斯坦福大学创建, 致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。 Bio-protocol 期刊是Bio-protocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今， Bio-protocol 已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的5000多篇实验方案，并且同 Science 、 eLife 等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年 Bio-protocol 期刊已被PubMed Central，ESCI收录。