1 实验目的
了解 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 测定蛋白质分子量的原理和基本操作技术。
2 实验原理
蛋白质是两性电解质，在一定的 pH 条件下会解离并带电。 当溶液的pH值大于蛋白质的等电点（pI）时，蛋白质本身带负电，会在电场中向正极移动； 当溶液的pH值小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中向正极移动。 负极移动； 蛋白质在特定电场中运动的速度取决于其携带的净电荷、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场的强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔隙结构。 本实验使用不连续凝胶系统。 通过调节双丙烯酰胺的用量，可以制成两层不同孔径的凝胶。 这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过两层凝胶时，延迟的程度就会不同，表现出不同的迁移速率。 由于上层凝胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔凝胶时基本受到相同的阻挡，因此它们的运动速度相同； 当进入小孔凝胶时，分子量大的蛋白质移动较慢。 因此，样品被压缩到两种凝胶之间的界面处的非常狭窄的区域中。
这通常被称为浓缩效应和分子筛效应。 同时，在制备上层凝胶（浓缩胶）和下层凝胶（分离胶）时，使用了两种缓冲系统； 上层凝胶pH=6.7-6.8，下层凝胶pH=8.9； Tris-HCl缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性和pH值，是缓冲抗衡离子； CI- 是主导离子。
在pH 6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，在pH=8.9时，Gly的解离度增加； 这样，浓缩胶和分离胶之间的pH不连续性控制了慢离子的解离。 距离，从而达到控制其有效移动的目的。 不同的蛋白质有不同的等电点。 进入分离胶后，各种蛋白质因静电荷不同而具有不同的迁移率。 由于聚丙烯酰胺凝胶电泳中的浓度效应、分子筛效应和电荷效应，可以在同一电场下有效分离不同的蛋白质。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS带有大量的负电荷，这种阴离子表面活性剂可以使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在的情况下，蛋白质分子中的二硫键还原，肽链充分延伸，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物； 此时，蛋白质分子上的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质之间电荷的差异。 蛋白质分子量越小，在电场中移动的速度越快； 反之，移动速度越慢。
蛋白质的分子量与其电泳迁移率之间的关系为：
Mr=K(10-b·m) logMr=LogK—b·Rm,
式中，Mr——蛋白质的分子量；
logK——截距；
b——坡度；
Rm——相对流动性。
实验表明，在15,000-200,000蛋白质分子量范围内，电泳迁移率与分子量的对数之间存在线性关系。 蛋白质的相对迁移率Rm=蛋白质样品的迁移距离/染料（溴酚蓝）迁移距离。 这样，在同一电场中进行电泳，并根据相应蛋白质分子量的对数绘制标准蛋白质的相对迁移率。 未知蛋白质的相对迁移率可用于从标准曲线计算其分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 方法简单、快速且重复性好，可用于测定蛋白质的分子量。
具有复性性好的优点，是目前一般实验室测定蛋白质分子量常用的方法。
3 试剂及主要设备
一、主要试剂
1) 标准蛋白质混合物
含有：磷酸化酶（分子量 94,000）、牛血清白蛋白（分子量 67,000）、肌动蛋白（分子量 43,000）、磷酸酐酶（分子量 30,000）和溶菌酶（分子量 14,000）
2) 30%凝胶储备液：Acr 30g，Bis 0.8g，加蒸馏水至100mL
3) 分离胶缓冲液(1.5mol/L)：Tris 18.15g，加水溶解，用6mol/L HCl调pH至8.9，稀释至100mL
4) 浓缩胶缓冲液(0.5mol/L)：Tris 6g，加水溶解，用6mol/L HCl调pH至6.8，定容至100mL
5) 电极缓冲液(pH8.3)：SDS 1g、Tris 6g、Gly 28.8g，加水溶解并定容至1000mL。 使用时稀释五倍。
6)10%SDS
7) 10%过硫酸铵（新鲜配制）
8)1%TEMED
9) Loading buffer：0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 1.25mL、50%甘油 4mL、10%SDS 2mL、巯基乙醇 0.4mL、0.1%溴酚蓝 0.4mL，加蒸馏水溶解至 10mL。
10) 0.25%考马斯亮蓝R-250染色液：1.25g考马斯亮蓝R-250，454mL 50%甲醇，46mL冰醋酸。
11)脱色液：冰醋酸35mL，蒸馏水465mL。
12) 未知分子量的蛋白质样品（1mg/mL）
2、实验设备
1）DYCZ-24D立式平板电泳槽（北京六仪仪器厂）
2）电泳仪
3) 长滴管和微量注射器
4）烧杯（250mL，500m1），量筒（500mL，250m1），培养皿（15cm´l5cm）
5) 注射器等
4. 实验操作
1. 安装单板
将密封硅胶框放在平板玻璃上，然后将凹面玻璃与平板玻璃重叠。 将两块玻璃竖立起来，使底端接触桌子。 用手夹住两片玻璃放入电泳槽中，然后插入斜插片。 当板面达到适中高度时，即可浇胶。
2. 凝胶聚合
分离胶和浓缩胶的制备：按表中溶液顺序和比例制备10%分离胶和4.8%浓缩胶。
试剂名称
10%分离胶/mL
4.8% 浓缩胶/mL
Acr/Bis 30%
分离胶缓冲液（pH8.9）
浓缩胶缓冲液 (pH6.8)
10%十二烷基硫酸钠
10%过硫酸铵
水
泰美德
3.75
0.15
0.1
1.6
1.25
0.1
0.1
4.95
添加上表中的每种溶液并充分混合以制备分离凝胶。 用滴管沿着凝胶室长玻璃板的内表面缓慢滴加凝胶溶液，注意不要产生气泡。 添加胶液直至距短玻璃板边缘2cm处，约5mL。 然后用细滴管或注射器小心地注入少量水，约0.5-1mL。 在室温下聚合 30-40 分钟。
分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。 用长滴管小心加入分离胶中，插入样品模具（梳子）； 待堆积胶聚合后，小心拉出样品模具。
3. 蛋白质样品的处理
若标准蛋白或待分离蛋白样品为固体，称取样品1mg，溶解于1mL 0.5mol/L pH6.8 Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中； 如果样品是液体，测定蛋白质浓度并按1.0至1.5 mg。 /mL溶液比例，取等体积的蛋白质样品溶液和样品处理溶液，混合均匀。 本实验所用样品为15-20 mg标准蛋白样品溶液。 将其置于0.5 mL离心管中，加入15-20 ml样品处理溶液。 在100°C水浴中处理2分钟，冷却至室温并备用。
取20ml未知分子量的蛋白质样品，按照标准蛋白质处理方法进行处理。
4.添加样本
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳上样方法
用手夹住两块玻璃板，抬起斜插板将其松开，然后取下玻璃胶室并取下密封硅胶框。 注意，在上述过程中，手始终要给玻璃胶室一个夹紧力，然后将玻璃胶室取下。 将电泳槽放置，凝胶室凹面朝内，插入斜板，在内槽玻璃凹面处添加缓冲液，在外槽距离上边缘3mm处添加缓冲液的平板玻璃。 小心避免电泳槽内产生气泡。
添加样品时，可以使用进样器靠入手柄边缘的凹槽，准确定位样品添加位置，或使用微量注射器依次向每个样品槽添加样品，添加10至15毫升（每份含有 10 至 15 毫克蛋白质）。 ，可加入20~30ml稀溶液（必须根据胶水的稠度灵活控制）。
5.电泳
添加样品后，关闭上盖，连接电泳仪。 打开电泳仪开关后，电流控制在15-20mA，然后将样品送入凝胶，约15-20分钟； 样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶后，电流升高。 30~45mA，电泳过程中电流保持稳定。 当溴酚蓝指示剂迁移至距前沿1～2cm时电泳停止，大约需要1～2小时。 若室温较高，可打开电泳槽循环水，降低电泳温度。
6、染色、脱色
电泳完成后，关闭电源，取出玻璃板，用小刀轻轻撬开长、短玻璃板下角之间的缝隙，使胶面与一块玻璃板分离，然后轻轻提起薄膜、指示区中央插一根铜丝作为标记，放入大培养皿中染色，用0.25%考马斯亮蓝染料，染色2～4小时，必要时可过夜。
弃去染色液，用蒸馏水冲洗橡胶表面数次，然后加入脱色液进行扩散脱色，并经常更换脱色液，直至蛋白条带清晰。
7.结果处理
1）测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白样品的移动距离（即蛋白条带中心到加样孔的距离），并测量指示染料的迁移距离。
2）根据下式计算蛋白质样品的相对迁移率（Rm）
相对迁移率=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）
3）标准曲线的制作：以各标准蛋白的相对淌度为横坐标，蛋白分子量的对数为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，得到标准曲线。
4）测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对淌度，从标准曲线上求出蛋白质的分子量。
5.思考问题
1. 聚丙烯酰胺圆盘凝胶电泳有哪些不连续性？
2. 电泳过程中的三种物理效应是什么？ 它们是如何引起的？
3. 电泳后上下槽的缓冲液可以混合使用吗？ 为什么？
4. 加样缓冲液中添加甘油的目的是什么？
5、保存液配制和保存时应注意什么？
6、实验中过硫酸铵、7%醋酸、考马斯亮蓝的作用是什么？