组织石蜡切片交联是一种常见的组织学技术，用于制备生物样本切片以便于显微镜观察。这种技术可以使细胞和组织在处理和切片过程中保持形态完整，并固定其结构，防止其受到损伤。

图1：福尔马林固定对RNA、RNA和蛋白的影响

该技术的步骤如下：

1.组织固定：首先需要将要切片的组织固定。这可以通过使用化学固定剂（例如福尔马林）或冷冻固定来完成。

2.脱水：接着需要将组织脱水。这个过程将水从组织中去除，使得组织内的空隙被填充了蜡。通常使用不同浓度的乙醇逐渐稀释水分。

3.渗透：在脱水后，需要将蜡经由乙醇逐渐替换进入组织。这个过程称为渗透。最后用组织石蜡取代了乙醇，使它们完全被浸透到组织中。

4.包埋：组织蜡将被转移到一个模具中并在这里硬化。这个过程称为包埋。通常在65°C的烤箱中进行，并用冷却的工作台冷却。

5.切片：在包埋完成后，需要使用切片机将组织切成薄片。这些切片通常比5-10微米厚，并可以用于显微镜观察。

图2：组织石蜡切片

在以上所有步骤中，都存在一个关键的步骤，那就是交联。石蜡是一种软质材料，但在切片时可能会变形或损坏。因此，在包埋前需要对切片进行交联。这可以通过加热、紫外线辐射或化学处理等不同方法来实现。交联可以使蜡更加牢固，有助于保持切片完整。

01 组织石蜡切片容易交联的场景

01 加热时的氧化反应

组织石蜡通常在制备过程中需要加热，加热时会产生氧化反应，使得其中的双键或羰基化合物发生交联反应，从而导致石蜡分子之间的交联。这些反应可以通过控制加热温度和时间等因素来减轻，但是如果处理不当或者使用老化的石蜡，则可能会导致严重的交联。

02 环境因素的影响

除了加热外，其他环境因素也可能促进组织石蜡的交联。例如，高温、紫外线、湿度等都可能导致石蜡中的化学键发生变化，并引起交联反应。此外，水分和各种化学物质的存在也可能对石蜡的稳定性和交联产生影响。

因此，在制备和处理组织石蜡切片时，需要注意材料的质量和存储方式，并尽可能控制环境因素，以避免产生不必要的交联反应。

02 如何解交联减少RNA降解？

在石蜡嵌入过程中，组织样本被固定在石蜡中，这形成了交联结构，使得RNA降解变得更加困难。在后续组织石蜡切片中提取RNA时需要解交联步骤，恢复样本的天然形态和结构。常用的解交联方法有热水解交联法、酸性解交联法、*水氨**解交联法、溶剂解交联法。

可以采取以下步骤：

01 脱除石蜡

常用热水解交联法，将切片放入缓冲液离心管中，水浴加热溶解石蜡；或者用溶剂解交联法将切片浸泡在去除剂中或者有机溶剂离心管中，这些溶剂可以逐渐溶解石蜡，并破坏石蜡中的交联结构。在此过程中，必须注意使用防护手套和通风条件。

图3：组织石蜡切片水浴加热溶解石蜡

02 溶解交联结构

将切片浸泡在高盐缓冲液（例如0.4M NaCl或2M NaCl）或蛋白酶K等蛋白酶消化剂中，这些物质可以解开交联结构，并释放出RNA。此外，高温有助于解开交联，FFPE RNA提取时一般可以采用80℃的高温，半个小时进行解交联。

03 去除RNA酶

提取所用试剂均为DEPC水配制（DNA酶也是RNase free的），可以有效抑制RNA酶的活性，这有助于保护RNA不受RNA酶的降解。

04 去除蛋白质

使用蛋白酶消化剂等物质可以去除切片中存在的蛋白质，使得RNA裸露在表面上，这样有利于后续的操作。

03 组织石蜡切片RNA提取其它难点

01 RNA质量和纯度

石蜡切片中的RNA通常存在严重的降解和污染，因此需要进行多次洗涤步骤以去除杂质。另外，由于石蜡切片通常存放时间较长，因此还需要评估RNA的完整性和纯度，以确保所提取的RNA适合后续的分析。

02 样品量问题

由于石蜡切片组织经过了一系列处理，如固定、脱水、浸蜡等，这些处理可能导致组织质量的损失。因此，石蜡切片中的RNA含量通常很少，可能需要对样品进行多次提取才能获取足够的RNA量。

03 PCR抑制

由于石蜡切片RNA中可能存在PCR抑制物，如某些成分的弱酸和多聚酶*制剂抑**等，所以需要选择合适的方法来去除这些干扰物质，从而保证PCR反应的准确性和稳定性。