你知道吗？磷脂酰肌醇-3-激酶催化细胞内磷脂酰肌醇的磷酸化，

磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3kinases，PI3Ks）负责催化细胞内磷脂酰肌醇的磷酸化，在蛋白质合成、细胞增殖、分化、迁移、自噬和凋亡等多种生理功能中发挥着重要作用，与多种肿瘤的发生密切相关。

PI3Ks分为3个亚族，其中Ⅰ亚族的PI3Kδ可介导B细胞的恶性增殖、存活和迁移。

目前，艾代拉里斯（Idelalisib）、杜韦利西布（Duvelisib）、厄布利塞（Umbralisib）和林普利塞（Linperlisib）等PI3Kδ*制剂抑**作为B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）的治疗药物，已获批上市。

然而，靶向PI3Kδ在实体瘤治疗方面的应用研究相对较少。

近期研究表明，PI3Kδ亦是包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和肝癌在内的多种实体瘤的内在驱动因素。

在乳腺癌细胞中，可观察到PI3Kδ的异常表达，而抑制PI3Kδ可通过干预肿瘤细胞内信号通路及调控肿瘤微环境的双重机制，发挥抗乳腺癌作用。

在前列腺癌以及肝癌发展的过程中，同样可见PI3Kδ的表达逐渐升高，而Idelalisib可发挥显著的体内外抗肝癌效果。

因此，靶向PI3Kδ在治疗实体瘤方面同样具有应用前景。

尽管PI3K*制剂抑**的研发已取得诸多成果，但现有PI3K*制剂抑**均存在疗效不足以及耐药等问题。

单独干预PI3K信号通路，可引起互补信号通路的交叉激活，从而诱发耐药。

组蛋白去乙酰化酶（Histonedeacetylases，HDACs）是表观遗传学中的重要抗癌靶点。

研究表明，PI3K*制剂抑**与HDAC*制剂抑**联合用药不仅可提高疗效，亦能延缓耐药的发生。

较之联合用药，单分子双靶点药物可规避药物间相互作用，简化药物代谢动力学，提升患者的依从性。

目前，基于PI3K泛*制剂抑**和HDAC*制剂抑**分子结构所设计的融合型分子CUDC-907正处于临床研究中。

然而，该化合物由于对PI3K、HDAC均缺乏亚型选择性，毒副作用显著，故临床试验停滞不前，且不适用于实体瘤治疗。

而基于具有PI3Kδ亚型选择性的结构骨架，设计相应的融合型分子，有望解决该问题。

在前期工作中，本团队发现一活性优异的PI3Kδ选择性*制剂抑**TGMXD-208。

该化合物的PI3Kδ结合模式表明，其喹唑啉酮母核的N-3位指向溶剂区，故可供HDAC药效片段的引入。

同时，本团队在开展HDAC*制剂抑**研究的过程中，发现哌啶取代的嘧啶异羟肟酸片段对抑酶活性、ClassIHDAC亚族选择性尤为重要。

因此，本团队拟采用药效团融合策略，将该片段并入TGMXD-208喹唑啉酮母核的N-3位，以发现具有进一步研究价值的新型抗实体瘤喹唑啉酮类化合物。

为验证该类融合型分子抗实体瘤的可行性，我们初步设计、合成了3个结构新颖的喹唑啉酮衍生物，并评价了其对前列腺癌细胞PC-3、乳腺癌细胞MDA-MB-231、乳腺癌细胞T-47D和人脐静脉内皮细胞HUVECs（正常细胞）的增殖抑制活性。

活性筛选结果表明，上述化合物对受试实体瘤细胞株，呈现出显著的体外抗增殖活性，同时对正常细胞的毒性较低。

LY-TP12W12V型分析天平（上海西艾爱电子有限公司）；ZF-7型三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；WB-2000型水浴锅、R-1001VN型旋转蒸发仪、DLSB-5/20型低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵、DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（河南予华仪器有限公司）；AvanceII400MHz型核磁共振仪、OrbitrapExploris120型质谱仪（赛默飞世尔科技公司）；三气培养箱（Thermo公司）；BertholdLB941型微孔板式多功能酶标仪（Berthold公司）。

二甲基*砜亚**、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二异丙基乙胺、氢氧化钠（分析纯或化学纯，上海安耐吉化学有限公司）。

将4.48g（14.54mmol）化合物9a溶于30mL乙醇中，加入1.78g（44.56mmol）氢氧化钠，升温至80℃回流反应4h。

待反应结束，冰浴下以浓盐酸调至pH7~8，用乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液（100mL×3）洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥后过滤，滤液浓缩，残留物经硅胶柱层析，得到2.62g白色固体，产率63%。

将0.70g（1.86mmol）化合物10a溶于15mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.67g（2.05mmol）(1-(5-(甲氧羰基)嘧啶-2-基)哌啶-4-基)甲磺酸甲酯、0.28g（2.05mmol）碳酸钾，升温至60℃回流反应10h。

将0.33g（0.54mmol）化合物11a溶于4mL无水二氯甲烷中，冰浴下加入0.74g（6.48mmol）三氟乙酸，室温反应4h。

待反应结束，冰浴下以饱和碳酸氢钠水溶液调至pH7~8，用二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液（50mL×3）洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥后过滤，滤液浓缩，残留物经硅胶柱层析，得到0.27g白色固体，产率93%。

将0.25g（0.49mmol）化合物12a溶于5mL二甲基*砜亚**中，加入0.08g（0.49mmol）2，4-二氨基-5-氰基-6-氯嘧啶、0.06g（0.98mmol）氟化钾、0.19g（1.47mmol）N，N-二异丙基乙胺，于N2氛围下，升温至90℃回流反应10h。

待反应结束，向反应瓶中加水、静置，析出固体，抽滤，滤饼经硅胶柱层析，得到0.21g白色固体，产率90%。

将0.10g（2.50mmol）氢氧化钠溶于1.5mL羟胺中，冰浴搅拌0.5h后，加入0.20g（0.31mmol）化合物13a、4mL混合溶剂[V（四氢呋喃）:V（甲醇）=1:1]，室温反应5h。

待反应结束，冰浴下以浓盐酸调至pH7~8，用乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液（50mL×3）洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥后过滤，滤液浓缩，残留物经硅胶柱层析，得到0.18g白色固体，产率87%。

1HNMR（DMSO-d6，400MHz），δ：11.06（s，1H，OH）；9.01（s，1H，NH）；8.66（s，2H，Ar—H）；7.82~7.78（m，2H，Ar—H）；7.68~7.64（m，1H，Ar—H）；6.45（s，2H，NH2）；6.14（s，2H，NH2）；5.64（s，1H，CH）；4.76（d，2H，J =13.0Hz，CH2）；4.51（s，1H，CH2）；4.21（m，1H，CH2）；3.94~3.77（m，2H，CH2）；3.85（s，1H，CH2）；3.00~2.80（m，2H，CH2）；2.55（s，1H，CH2）；2.09（m，1H，CH）；1.96~1.87（m，1H，CH2）1.80（m，2H，CH2）；0.64（d，1H，J =6.4Hz，CH2）；0.56（m，1H，CH2）；0.47（s，1H，CH2）；0.20（s，1H，CH2）。

13CNMR（DMSO-d6，100MHz），δ：167.10，165.81，162.50，161.79，161.76，157.59，153.88，140.70，134.14，129.57，127.46，123.63，123.18，120.16，116.05，114.61，112.99，63.44，60.84，49.38，46.68，46.02，43.79，43.72，35.25，19.21，14.42，9.03。

HR-MS，m/z：643.2393[M+H]+。

(S)-2-(4-((5-氯-2-(1-(2，6-二氨基-5-氰基嘧啶-4-基)吡咯烷-2-基)-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)甲基)哌啶-1-基)-N-羟基嘧啶-5-甲酰胺（14b）：白色固体，产率83%。

1HNMR（DMSO-d6，400MHz），δ：11.07（s，1H，OH）；9.01（s，1H，NH）；8.66（s，2H，Ar—H）；7.81~7.77（m，2H，Ar—H）；7.65（m，1H，Ar—H）；6.43（s，2H，NH2）；6.09（s，2H，NH2）；5.48（d，1H，J =7.7Hz，CH）；4.80~4.72（m，2H，CH2）；4.50（m，1H，CH2）；4.23（m，1H，CH2）；4.07~3.97（m，1H，CH2）；3.95~3.82（m，1H，CH2）；3.06（q，1H，J =7.3Hz，CH2）；3.00~2.83（m，2H，CH2）；2.35（m，1H，CH）；2.15~2.02（m，2H，CH2）；2.01~1.91（m，2H，CH2）；1.82（t，2H，J =14.2Hz，CH2）。

13CNMR（DMSO-d6，100MHz），δ：167.08，165.66，162.56，161.87，161.75，157.59，153.94，140.71，134.16，129.58，127.45，123.64，123.18，120.07，116.04，114.60，112.91，63.80，60.75，57.07，46.72，43.77，43.69，35.21，28.72，28.36，19.28。

HR-MS，m/z：617.2243[M+H]+。

(S)-2-(4-((5-氯-2-(1-((2，6-二氨基-5-氰基嘧啶-4-基(氨基(丙基)-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)甲基)哌啶-1-基)-N-羟基嘧啶-5-甲酰胺（14c）：白色固体，产率80%。

1HNMR（DMSO-d6，400MHz），δ：11.06（s，1H，OH）；9.00（s，1H，NH）；8.67（s，2H，Ar—H）；7.89~7.78（m，2H，Ar—H）；7.70（d，1H，J =6.7Hz，Ar—H)；6.64（s，2H，NH2）；6.60（d，1H，J =8.1Hz，Ar—H）；6.43（s，2H，NH2）；5.27（t，1H，J =6.4Hz，CH）；4.78（d，2H，J =12.5Hz，CH2）；4.57~4.40（m，2H，CH2）；3.00（t，2H，J =7.2Hz，CH2）；2.30~2.18（m，1H，CH2）；2.15~2.03（m，1H，CH）；1.96（s，1H，CH2）；1.92（d，2H，J =8.4Hz，CH2）；1.47~1.34（m，2H，CH2）；0.84（t，3H，J =7.2Hz，CH3）。

13CNMR（DMSO-d6，100MHz），δ：166.20，165.35，162.47，161.81，157.59，153.27，140.71，134.51，129.75，127.39，123.63，123.18，118.25，116.04，114.63，113.17，60.56，56.25，46.69，43.81，35.49，27.77，19.30，10.18。

HR-MS，m/z：605.2244[M+H]+。

用MTT法检测目标化合物对细胞（PC-3细胞株、MDA-MB-231细胞株、T-47D细胞株、HUVECs细胞株）增殖的影响。

实验步骤如下：将细胞以1×104/孔的密度接种到96孔板中，置37℃、5%CO2培养箱培养过夜。

第2d弃去培养基，加入药物浓度为0.16、0.8、4、20、100μmol/L的含药培养基，每组设3个复孔，孵育96h后，向每个孔中加入20μL的0.5mg/mLMTT溶液，置培养箱中孵育4h后，弃去孔内液体，每孔加入100μL的二甲基*砜亚**，采用酶标仪测得490nm处的吸光度值，并计算抑制率，拟合量效曲线分析数据，得出IC50值。

基于配体/PI3Kδ蛋白复合物晶体结构（PDBcode4EX0）以及配体/HDAC1蛋白复合物晶体结构（PDBcode5ICN），将化合物分别与PI3Kδ以及HDAC1进行分子对接。

去除蛋白晶体内部原始配体和溶剂分子，对蛋白加氢并施加CHARMm力场，得到预处理的分子对接受体。

配体制备完成后，选取原始配体在酶中的位置作为活性位点，完成分子配体的预处理。

应用DiscoveryStudio2020软件中的CDOCKER模块将小分子配体与蛋白受体对接，综合打分函数和相互作用模式选取对接构象。

体外抗增殖活性测试结果表明，所有目标分子对PC-3、MDA-MB-231以及T-47D三种实体瘤细胞株均表现出优异的抗增殖活性，与阳性对照SAHA（上市HDAC*制剂抑**）、Idelalisib相当甚至更优。

较之其他细胞株，目标分子对PC-3细胞株的抗增殖活性最佳。

其中，化合物14a对PC-3细胞株的抗增殖活性最强（IC50为(0.164±0.006)μmol/L），且优于阳性对照SAHA以及Idelalisib。

此外，化合物14a对T-47D细胞株的抗增殖活性较之其他化合物更强（IC50为(3.567±0.161)μmol/L），而化合物14c对MDA-MB-231细胞株的抗增殖活性较之其他化合物更强（IC50为(1.419±0.152)μmol/L）。

较之阳性对照SAHA和Idelalisib，所有目标分子对正常细胞HUVECs的毒性更低，对肿瘤细胞呈现出优良的选择性。

化合物14a、14c对3种细胞株的抗增殖活性均优于两种阳性对照，在后续研究中，将进一步丰富化合物的结构多样性，以获得抗实体瘤活性更优的化合物。

化合物14a与PI3Kδ的分子对接结果表明，其2，6-二氨基-5-氰基嘧啶结构与铰链区氨基酸残基GLU826和ASP911产生氢键相互作用，同时，与氨基酸残基TYR813产生π-π堆积作用；喹唑啉酮母核位于特异性口袋中，与TRP760产生π-π堆积作用。

此外，连接于喹唑啉酮母核N-3位HDAC药效片段指向溶剂区，未与PI3Kδ蛋白产生空间冲突。

以上结合模式亦有望赋予化合物良好的PI3Kδ亚型选择性。

化合物14a的HDAC1蛋白对接结果表明，其结合模式亦较为合理——异羟肟酸基团可与催化口袋底部的Zn2+配位，并与HDAC1催化通道中氨基酸残基GLY149产生氢键相互作用，而嘧啶环可与HDAC1催化通道中的氨基酸残基PHE150和PHE205产生π-π堆积作用。

综上，化合物14a与PI3Kδ和HDAC1的结合模式合理，有望产生双靶抑制活性。

该研究采用药效团融合策略，以PI3Kδ*制剂抑**TGMXD-208为先导物，通过在其母核的N-3位并入本团队前期发现的HDAC活性片段设计、合成目标分子，并经抗增殖实验，得到3个具有优良体外抗实体瘤活性的喹唑啉酮衍生物。

其中，化合物14a与14c对3种实体瘤细胞株的抗增殖活性均优于阳性对照SAHA和Idelalisib，且对正常细胞毒性较低。

分子对接结果显示，化合物14a与PI3Kδ蛋白以及HDAC1蛋白的结合模式合理，有望产生双靶抑制活性。

以上研究结果初步证实了所设计的融合型分子抗实体瘤的可行性，并为进一步丰富此类分子的结构多样性、开展系统的构效关系研究奠定了基础。