文｜鹤白贤人
编辑｜鹤白贤人
«——【·前言·】——»
关于微生物代谢的理解，对人们认识生物体如何在不同环境中生存和适应至关重要。
黄青霉是一种广泛存在于自然界中的真菌，它在农业和食品工业中具有重要意义。
黄青霉的代谢过程不仅关系到食品和饲料的质量和安全，还与其产生的代谢产物，如黄曲霉毒素等，对人类健康和农业经济造成的威胁密切相关。
随着环境污染的加剧以及工业化进程的不断推进，洗涤剂样应激源成为了生物体在环境中面临的一种新挑战。
洗涤剂等化学物质的存在可能会对微生物的生长和代谢产生影响，甚至导致其生态系统的扰动，研究黄青霉代谢中洗涤剂样应激源的作用变得越来越重要。
与此同时，为了支持其正常生长和代谢活动，黄青霉需要从环境中获取各种营养物质，营养物质在微生物的生长、生存和代谢中起着关键作用。
然而，随着人类活动的改变，环境中营养物质的可用性可能会发生变化，从而影响微生物的代谢途径和生态功能。
«——【·生态影响·】——»
真菌栖息在不同的环境中，面临许多极端因素的限制，影响它们的生存。
这些压力因素包括：pH变化、渗透压变化、温度变化、氧化自由基、营养不足以及化学物质的暴露。
这些压力因素可以来自自然环境，也可以来自动植物和人类的免疫系统，作为对病原体的反应。
真菌对抗这些压力因素的防御机制基于细胞壁的结构，这在生物界中是独一无二的，细胞壁由α-和β-葡聚糖、N-乙酰葡聚糖、甘露蛋白以及其他各种糖蛋白组成。
当真菌细胞与这些压力因素接触时，细胞会通过启动特定基因的表达来合成蛋白质，从而使细胞能够在不良条件下生存。
正因为这个原因，丝状真菌具有在各种污染物存在下生长的潜力，能够分解这些污染物，并利用降解产物作为能源和碳源。
在众多污染物中，商业洗涤剂尤其引人注目，因为它们被广泛使用。
洗涤剂是复杂的混合物，其中包含表面活性剂SAA、柔软剂、氧化剂和各种酶，洗涤剂的pH值非常碱性，范围在9到12之间，被认为是强碱性物质。
众所周知，洗涤剂对水生生物和废水中的微生物有害影响。
洗涤剂作为污染物，通过工业和市政废水、农药施用或废活性污泥堆积进入环境，排放污水和SAA最终以其固态形式存在于沉积物中，对水生生物具有毒性并在食物链中富集。
同时还会排放CO2、SO2和NOx等气体，这些都是当今的主要问题之一。
含有高含量SAA的产品，如洗涤剂，会抑制单细胞藻类的生长，阻碍水的净化过程，形成泡沫，使呼吸和光合作用所需的溶解氧变得困难，并导致富营养化。
公共污水中洗涤剂的最大容许浓度为4 mg/L，而天然水体中的容许浓度为0.5 mg/L，对这些洗涤剂浓度具有耐受性的真菌种类的鉴定，在生物修复方面具有重要的实际应用意义。
黄曲霉是一种普遍存在于土壤中的丝状真菌，但也可能存在于水生环境中。
这个物种在工业上被用于生产多种次生代谢产物，包括青霉素，用于处理纸浆厂废水，生产酶等，一些黄曲霉物种因其分解不同异物化合物的能力，被看作有潜力的生物修复剂。
然而，对于商业洗涤剂作为压力因素，对普通黄金青霉生长和利用其代谢分解产物的潜力知之甚少。
洗涤剂在自然界中是一种复杂的污染物，在标准条件下可以被微生物降解，但降解速率非常低。
基于这些事实，分离和研究不同洗涤剂降解微生物菌株在生物技术和修复自然生态系统中具有重要的实际意义。
«——【·材料和方法·】——»
这个真菌菌株是从L塞尔维亚克拉古涅瓦茨的废水样本中分离出来的，取样地点是家庭污水排放入河流的地方。
在采样后的24小时内，将样本接种到含有链霉素的营养麦芽琼脂平板上，进行双份复制。
然后，将平板在室温下孵育，通过在贫营养麦芽琼脂平板和马铃薯葡萄糖琼脂平板上筛选培养，获得纯培养物。
该真菌在30°C条件下生长的PDA斜面上进行维持，存放在（4±0.5）°C下，并在无菌条件下每月进行次级培养，真菌在无菌的Czapek–Dox液体培养基中进行培养。
培养基的三角瓶在120°C下进行了20分钟的灭菌，在灭菌前，使用0.1 mol L−1 HCl将pH值调整为约4.70，液体培养基储存在三角瓶中，使用一个没有洗涤剂但有孢子的阳性对照组。
两个不同浓度的洗涤剂加孢子的测试组，以及两个有洗涤剂但无孢子的阴性对照组，接种时使用1毫升孢子悬液。
三个重复的三角瓶放置在一个电动摇床上，以实现均匀且持续的混合。所有实验在室温下进行，轮流照明和黑暗16天，接种后的第三天开始取样。
然后每隔三天重复一次，直到实验结束，用Whatman滤纸No. 1过滤去除菌丝，确定菌丝的干重生物量，通过在10,000转/分钟下离心收集滤液，上清液被用作粗酶提取物。
pH和氧化还原电位，是通过班特型号为PHS-3BW的数字电子pH计和玻璃电极型号65-1进行测量的。
碱性葡萄糖转化酶活性，是在反应混合物中测定的，该混合物包括0.06 mol/L的蔗糖、0.02 mol/L的柠檬酸盐缓冲液和300 μL酶溶液，总体积为1 mL。
将混合物在37°C下孵育30分钟，酸性葡萄糖转化酶活性的反应混合物包含相同的成分。
不同之处在于柠檬酸盐缓冲液被替换为0.1 mol/L的乙酸钠缓冲液，将混合物在55°C下孵育30分钟。
通过Somogyi–Nelson方法，在410 nm处光谱测定释放的还原糖量，单位葡萄糖转化酶活性定义为在37°C下，使1 μmol葡萄糖每分钟生成的酶量。
碱性磷酸酶ALP活性，以β-甘油磷酸盐作为底物进行测定，反应混合物包含等体积的0.05 mol L−1甘醇缓冲液，激活剂Mg2+，底物和发酵液。
在37 °C下孵育30分钟后，通过加入10%三氯乙酸停止反应，并在冰上存放15分钟。
使用NH4-钼酸盐溶液，进行颜色发展和游离无机磷酸盐Pi的测定，吸光度使用Perkin-Elmer Lambda 25紫外-可见光分光光度计在660 nm处测量。
在检测条件下，酶活性的一个单位IU，定义为酶在一分钟内释放1微克无机磷酸盐的数量。
阴离子表面活性剂，是通过使用亚甲基蓝的分光光度法来测定的，用于测定洗涤剂中亚甲基蓝活性物质MBAS浓度。
所有实验均进行了三次，并将结果表示为均值±标准偏差。
进行统计分析时，使用了以下测试：Mann-Whitney、Kruskal-Wallis以及SPSS统计软件包中的相关系数测试，相关系数的显著性水平为0.05和0.01。
«——【·探讨·】——»
洗涤剂浓度为0.3%和0.5%对金黄色念珠菌的影响，包括pH值、氧化还原电位、有机酸浓度、酶活性和总干重生物质的变化。
同时，还测试了真菌降解商业洗涤剂以及利用降解产物作为碳和能源源的能力。
这些参数在不同的生理生长阶段进行了监测，测试的洗涤剂浓度，比大多数生物所能承受的允许浓度高出数千倍，甚至致命。
培养基的化学组成和实验条件，会影响真菌的生长和总生物量，Czapek-Dox液体培养基具有良好的真菌培养性能和高生物量产量。
在Czapek-Dox液体培养基C中培养的P. chrysogenum菌株从接种到第6天呈单相指数生长。
在指数生长期末和静止期开始阶段，观察到最大的总干重生物量为1.6423克。
在第12天，由于培养基中蔗糖耗尽，自溶作用开始，这在实验结束时导致生物量的微不足道的降低。
生长基质中存在不同的污染物，会影响真菌的生长和发育，表面活性剂对真菌的杀菌效果主要取决于微生物种类、表面活性剂分子疏水部分的大小和施加的浓度。
0.5%的洗涤剂表现出杀菌效果，D5培养基中的生物量在实验期间未被检测到。
有趣的是，在D3培养基中培养的真菌表现出单相指数生长，但平稳期延长至第16天，可能是因为利用了洗涤剂降解产物作为额外的碳源。
在D3培养基中，最大的总干重生物量在第16天测得，但比C培养基少了61.84%，总干重生物量的减少，可以通过某些降解产物或洗涤剂本身对真菌生长的毒性影响来解释。
洗涤剂对参与关键代谢途径的酶具有抑制作用，真菌生长还受到表面活性剂与真菌结构之间的物理化学相互作用的影响。
阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠SDS会抑制生长，而非离子表面活性剂，如Triton X-100和Tween 80，真菌对其耐受性较好。
真菌分离物显示出迅速生长的能力，第3天就观察到真菌生物量。
非常短的适应期，表明真菌在遗传上对测试浓度的洗涤剂具有适应性，并合成了必要的降解酶。
在真菌指数生长期间，阴离子洗涤剂成分的生物降解最高，这与其他作者的研究结果一致，证实了表面活性剂的降解速率与细胞生长是同步的。
仅在接种的液体培养基中评估了P. chrysogenum对商业洗涤剂的生物降解能力，洗涤剂浓度为0.3%。
由于洗涤剂在0.5%的浓度下显示出杀菌效果，因此没有在D5培养基中进行进一步的测量。
在阴性对照结果显示，被测试的洗涤剂在化学上是稳定的，在D3培养基中，初始洗涤剂浓度为3 mg mL-1 ，随着菌丝生长不断减少。
在前三天内，真菌分解了初始洗涤剂浓度的15.63%，从第3天到第6天，生物降解百分比为26.73%。
从第6天到第9天，为31.03%，从第9天到第12天，为36.567%。
在第16天，洗涤剂浓度为1.509 mg mL-1，也就是初始洗涤剂浓度的总共50.2%。
在指数生长阶段，真菌分解了洗涤剂最高百分比的部分，在稳定生长阶段，真菌对洗涤剂的阴离子成分降解的数量较少。
所测试的洗涤剂含有20%的阴离子表面活性剂，这已通过MBAS检测确认，换句话说，在D3培养基中的初始阴离子表面活性剂浓度为600 μg mL^-1，如下图所示。
真菌在16天内分解了D3培养基中约301 μg mL^-1的阴离子表面活性剂。
生物降解速率取决于表面活性剂的类型、浓度以及微生物种类。
两株细菌Pseudomonas betelli MH1和Acinetobacter johnsoni MH2在碱性pH和室温下，具有在五天内分解线性烷基苯磺酸盐LAS初始浓度的93.6%和84.6%的能力。
LAS的最高降解发生在对数生长阶段，P. chrysogenum能很好地耐受非离子表面活性剂，如Tween 80。
在这种表面活性剂的存在下，能够在两天内将一些其他污染物如芴的生物降解率从28%提高到61%。
在连续生物反应器中，假单胞菌培养液在20天后可将阴离子表面活性剂水平减少约70%，然而P. chrysogenum对于非离子表面活性剂，如Tween 80，具有较好的耐受性。
柠檬酸杆菌具有在35小时生长后降解超过90％阴离子表面活性剂的能力。
约翰逊不动杆菌菌株可以在五天内利用原始的SDS水平的94%，即P. chrysogenum积极利用添加到液体Czapek-Dox培养基中的商业阴离子型洗涤剂进行新陈代谢。
值得注意的是，尽管降解百分比较细菌菌株所实现的较低，但测试的浓度较高。
«——【·笔者结语·】——»
将商业洗涤剂加入液体Czapek–Dox养分培养基中，在0.3%的浓度下对P. chrysogenum的新陈代谢起到了一种应激和养分的作用，而在0.5%的浓度下则具有杀菌效果。
洗涤剂的应激作用表现在底物的碱化、氧化还原电位的降低、葡萄糖酶和磷酸酶活性的抑制，以及总干重生物量的减少。
这些变化在孢子发芽阶段和菌丝发育的早期阶段最为显著，真菌在洗涤剂存在下产生的一些有机酸可能在生物技术和药理学方面有实际应用。
P. chrysogenum可能降解阴离子洗涤剂成分，并利用降解产物进行代谢。这种能力在污水处理厂和非侵入性、能带来经济效益的生物修复技术中，具有格外的实际意义。
«——【·参考文献·】——»
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