该作品讲述了薇奥拉和她的双胞胎哥哥西巴斯辛在伊利里亚海岸附近船只失事。两人都认为对方溺水遇难。薇奥拉女扮男装，自称西萨里奥，成为奥西诺公爵的侍从。公爵派西萨里奥替自己向奥丽维亚小姐求爱，但奥丽维亚却爱上了这位可爱的"男孩"。扮成西萨里奥的薇奥拉则爱上奥西诺。西巴斯辛被安东尼奥船长救起，也来到伊利里亚。马伏里奥，奥丽维亚的管家，和家里其他人都合不来，包括奥丽维亚的族人托比爵士、他的朋友安德鲁爵士和小丑费斯特。在奥利维亚的侍女玛利娅的机智领导下，他们一起策化让马伏里奥倒台。奥丽维亚见到西巴斯辛，把他当成西萨里奥，安排和他秘密成婚。因为弄错了两个双胞胎身份，更多混乱接踵而至。奥西诺对自己的侍从的期骗大发雷霆，但等到最后双胞胎见面，一切真相大白，奥西诺承认了自己对薇奥拉的爱情。
《第十二夜》是莎士比亚早期喜剧。这部作品以抒情的笔调，浪漫喜剧的形式，讴歌了人文主义对爱情和友谊的美好理想，尤其塑造了女性的智慧、机智、果敢形象。
《第十二夜》这个名称，是因圣诞节后的第十二天，即一月六日，是一个节日，即所谓"十二日节"（Twelfthtide），又称"主显节"（Epiphany），纪念耶稣诞生后，东方的博士于此日来到伯利恒朝拜耶稣的故事。在这一天，不仅教堂里要照例举行仪式，在宫廷里和贵族家里也常常演剧庆祝。莎士比亚此剧显然是为这样的节日而写的，故命名为第十二夜。该命名与内容无关。
莎翁在此剧中对人生、人性的评论深刻而不乏机敏，摘记点评如下:
一、有人生来高贵，有人赢来高贵，还有人高贵逼上身来(some are born great, some achive greatness, and some have greatness thrust upon'em)
该句剧中出现多次，以我看来，奥西诺公爵和奥丽维亚小姐是生来高贵;双胞胎妹妹薇奥拉用智慧、温婉赢得公爵芳心，是赢来高贵;而双胞胎哥哥西巴斯辛一遇见奥丽维亚小姐，就被她错当成西萨里奥而成就姻缘，可谓高贵逼上身。这既是对人生无常的慨叹，也是对富贵、造化弄人的洞察。
二、聪明人总是觉得自己聪明，不料总是证明是傻子(those wits,that think they have thee,Do very oft prove fools)
剧中管家马伏里奥是典型代表，男性角色亦多如此。而生活中聪明反被聪明误的人和事亦比比皆是。
三、敌人让我变得更好，朋友让我更糟。所以从敌人那里我了解我自己，但从朋友那里，我只会上当受骗(the better for my foes and the worse for my friends.So that by foes, I profit in the knowledge of myself, and by my friends I am abused)
其义不言自明，人皆愿沉醉于朋友的欣赏包容，而对手的攻击却能直指我们的弱点，使我们反躬自省。
四、时光流转，迟早报应会来(the whirligig of time brings in his revenges)
一如不是不报，时候未到。
五、女人如玫瑰，其艳丽花朵，一旦绽放，同一刻即凋落(for women are as roses,whose fair flower being displayed, doth fall that very hour)
凋零，正在她们风华正茂时(to die, even when they to perfection grow)
青春易逝，韵华难留。若晏殊词:无可奈何花落去;又如李后主句:林花谢了春红，太匆匆。无奈朝来寒雨晚来风。莎翁无限慨叹，恰似一江春水向东流。
六、我们男人说得多，发誓多，但其实表演多过心愿，因为我们是在证明泛滥的是誓言，欠缺的是爱情(we men may say more, swear more but indeed, our shows are more than will, for still we prove, much in our vows, but little in our love)
此句莎翁对恋爱中男人虚情假意的揭露可谓一针见血，亦可作为对恋爱中女人的善意提醒。千百年男人却依然按此剧本上演，而又有多少恋爱中女人依旧上当受骗。
男人的嘴，信你个鬼。当下网络流行语是对这句话的正确解读。
七、这好比送人一条狗，再把狗要回去作为补偿(this is to give a dog and in recompense desire my dog again)
语言诙谐幽默，可博一笑。
他非一代骚人，实属万古千秋。