中医药是瑰宝，若用LC-MS/MS分析，板芪清肺方发酵代谢差异有哪些

中医药是中华传统医学的瑰宝，中兽药在治疗动物疾病中不仅显示出独特疗效，而且还具有毒副作用小、安全、绿色、无污染等诸多优势。

依据畜禽呼吸系统疾病的辨证施治理论，结合中草药配伍原则，筛选了由板蓝根、桔梗、前胡、冬桑叶、甘草、黄芪等多味中药组成的板芪益肺方剂。

中药炮制技术是中草药加工生产中的重要环节，利用益生菌对中药材进行固态发酵，可以使药物中的有效活性成分从中药材释放出来，不仅可以提高药效，还可以将一些大分子物质代谢成为一些小分子成分，并降低药材的毒副作用，避免宝贵中药材的浪费。

刘秋瑾等采用解淀粉芽孢杆菌对黄芪、板蓝根进行固态发酵，结果表明，二者发酵后多糖含量提高了42.85%。

陈银翠等采用冠突散囊菌固态发酵黄芪，结果显示，发酵后黄芪甲苷含量提升了2倍。

乔宏兴等采用植物乳酸杆菌固态发酵黄芪，结果显示，发酵后黄芪有机酸含量显著提升，多糖含量增加了2.3倍，另外，蛋鸡和肉鸡的应用试验显示，发酵黄芪可提升二者的生长性能。

目前，虽然明确了中草药粉末经过发酵后较中草药原粉末活性物质含量上存在差异，但是其具体的差异物和差异代谢通路尚不明确，所以将差异代谢物进行鉴定可以更好地明确药物的活性物质和药效作用机制。

近年来，代谢组学技术被成熟应用于生物组织代谢物的定量、定性研究中心，辅助分子生物学手段可以鉴定出差异代谢产物种类、分析差异代谢通路。

本研究利用液相色谱质谱/质谱联用(LC-MS/MS)技术对贝莱斯芽孢杆菌发酵的板芪清肺组方和未发酵的板芪清肺组方代谢产物进行分析，探究小分子代谢物的变化，经多元分析和KEGG富集分析差异代谢通路，以期为发酵板芪清肺组方的药效机制研究提供理论依据。

材料

板蓝根、葶苈子、桔梗、冬桑叶、枳壳、甘草、黄芪购自连云港启创生物科技有限公司;贝莱斯芽孢杆菌由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院分离鉴定并保存。

主要试剂

*腈乙**(51101)购自Thermo公司;甲醇(M14583)和甲酸(F12844)购自TCI公司;甲酸铵(516961)购自Merck公司;Vanquish液相色谱仪和QExactiveHF-X质谱仪购自Thermo公司;ACQUITYUPLCHSST3(2.1mm×150mm，1.8μm)色谱柱购自Waters公司。

种子液制备

挑取贝莱斯芽孢杆菌菌粉溶于少量生理盐水中，取100μL涂布营养琼脂平板，37℃温箱培养24h。

观察菌落形态，挑取目标单菌落以划线的方式接种到另一个营养琼脂平板，37℃温箱培养24h。

对平板上菌落进行革兰氏染色，鉴定合格后挑取单菌落接种于装有5mL无菌营养肉汤的试管内，37℃振荡培养24h，即可作为种子液。

试验分组及处理

将中药粉(板蓝根、葶苈子、桔梗、冬桑叶、枳壳、甘草、黄芪)30%、黄豆粉10%、碳酸钙0.2%和水59.8%配制培养基，总质量50g，混匀置于烧杯中，封瓶膜封住烧杯口进行高压灭菌(121℃，15min)，设置2个试验组，即发酵板芪清肺组方组(Enzyme组)和未发酵板芪清肺颗粒组方对照组(Water组)每组3个重复样本(分别为Enzyme1～Enzyme3和Water1～Water3)。

Enzyme组以2%的剂量接种浓度为1×108 CFU/mL的贝莱斯芽孢杆菌，于37℃培养箱发酵72h;Water组直接置于37℃培养箱72h。

采样时用无菌棒将烧杯内培养物搅拌均匀，采样后做好标记，分别放置液氮备用。

样本检测前处理

样本置于4℃环境解冻，精确称量200mg样本于2mL的Ep管中，加入-20℃预冷的含2-氯-L-苯丙氨酸(4mg/L)的甲醇600μL，涡旋振荡30s;分别加入100mg玻璃珠，放入组织研磨器中，频率60Hz研磨90s;于室温超声15min，4℃条件下12000r/min离心10min;所得上清液过0.22μm滤膜，过滤液加入到检测瓶中，备用。

色谱条件

采用ThermoVanquish系统，使用ACQUITYUPLCHSST3(2.1mm×150mm，1.8μm)色谱柱，流速0.25mL/min，柱温40℃，进样量2μL。

正离子模式，流动相为0.1%甲酸*腈乙**(C)和0.1%甲酸水(D)，梯度洗脱程序。

质谱条件

采用ThermoQExactiveHF-X质谱检测器、电喷雾离子源(ESI)在正、负离子模式下分别采集数据。

正离子喷雾电压为3.50kV，负离子喷雾电压为-2.50kV，鞘气30arb，辅助气10arb。

毛细管温度325℃，以分辨率60000进行一级全扫描，一级离子扫描范围(质荷比m/z为81～1000)，并采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30%，二级分辨率为15000，采集信号前8离子进行碎裂，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。

数据处理

采用RXCMS软件包Ropls分别对样本数据进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型的第一主成分变量重要性值投影(VIP)结合P值以及单变量差异倍数(FC)进行降维分析。

根据PLS-DA模型中VIP，结合t检验的方法进行差异代谢产物的筛选(VIP>1，P<0.05)，得到差异代谢产物的火山图。

用置换检验方法对模型进行过拟合检验。

采用MetaboAnalyst软件包对筛选差异代谢分子进行功能通路富集和拓扑学分析。

本试验检测由上海派森诺生物科技有限公司进行。

PCA分析

正离子和负离子模式下，两组样本间有较好的分离，表明PCA分析对两组样本具有较好的区分效果，可以看出发酵组和对照组的代谢组成分和含量存在明显的差异。

在正离子模式下PC1占总变量的64.4%，PC2占总变量的10.0%，二者累计贡献率可达74.4%;负离子模式下PC1占总变量的55.8%，PC2占总变量的14.6%，二者累计贡献率可达70.4%;两个PC较好地说明了总体变量的情况。

PLS-DA分析

由PLS-DA模型可以看出，正离子和负离子模式下两组样本可以分散。

正离子模式下构建模型的R2=0.9992，Q2=0.9887;负离子模式下构建模型的R2=0.9994，Q2=0.9883;可以看出构建模型的拟合度良好，解释度和预测度均较好。

采用置换检验考察模型的建模效果，结果显示模型不存在过拟合现象。

代谢物差异分析

正离子模式下检测到61531个差异离子，可以定型鉴定的离子数目为34624个，发酵后含量高于对照组的代谢物有21779个，低于对照组的代谢物有12845个;负离子模式下检测到34739个差异离子，可以定型鉴定的离子数目为15762个，发酵后含量高于对照组的代谢物有10655个，低于对照组的代谢物有5107个。

差异代谢物聚类分析

将筛选到的差异代谢物进行聚类分析，以聚类热图的形式表示，不同位置的颜色条代表对应位置代谢物的相对表达量，可以直观展示两组样本间各差异代谢物的相对含量变化。

其中列代表样本，行代表不同代谢物，图中左侧的聚类树为差异代谢物聚类树。

鉴定出的差异代谢物可分为203类，其中，上调57类，下调146类。

主要上调差异代谢物包括雌马酚、乙炔二醇二乙酸酯、香草乙二醇、D-鸟氨酸、喹雌酚、胆固醇和乙酰胆碱等，下调差异代谢产物包括黄曲霉素、芥酸、肉豆蔻酸和黄嘌呤等，结合t检验的P<0.05和VIP>1为筛选条件，得到31种主要差异代谢产物。

其中22种差异代谢物含量上调，9种差异代谢物含量下调，差异代谢产物中脂类、酮类等氨基酸显著增加，酸类氨基酸显著降低。

代谢通路分析

对差异代谢产物进行KEGG富集和拓扑分析，筛选到148条差异代谢通路，显著代谢通路27条(P<0.05)，可注释到的每类代谢通路的代谢物数量，可以看出，与差异代谢产物相关性最高的代谢通路为近端小管碳酸氢盐回收、精氨酸生物合成、组氨酸和嘌呤衍生生物碱的生物合成等途径。

代谢组学技术可以全面反映出机体状态，被广泛应用于中兽医领域，如动物疾病模型的构建、中兽药的作用机制、药效物质基础的辨识、组方配伍的规律、中兽药安全性的考察等多方面应用。

代谢组学技术在中药复方物质基础的辨识中有大量的成功研究，Xie等基于代谢组学技术针对六味地黄片进行研究，发现其生物活性成分为马尿酸盐、染料木素、黄豆苷元、葡萄糖醛酸化合物等。

本研究采用LC-MS/MS结合多变量统计方法对发酵与非发酵板芪清肺组方中药材的代谢产物的差异进行分析，共检测到203类差异代谢物，通过PCA和OPLS-DA图可以看出两组样品之间的代谢物具有明显差异。

OPLS-DA结果显示，两组间的差异代谢物共有31种，其中22种差异代谢物含量上调，9种差异代谢物含量下调，这些差异物的产生可能与添加板芪清肺组方中药材后影响菌体生长密切相关。

板芪益肺方剂中君药成分为板蓝根和黄芪，均是兽医临床常用中药材，其主要成分包括多糖类、吲哚类、黄酮类、皂苷类、生物碱类、甾醇类、有机酸类、多种氨基酸和其他微量元素。

孔祥琳等采用非靶向代谢组学技术研究黄芪甲苷对动脉粥样硬化(AS)小鼠肝脏代谢的调控作用，结果表明，甘油-3-磷酸、十二烷酸、DL-2-氨基己二酸是黄芪甲苷抗动脉粥样硬化的药效物质基础。

曾涵芳等采用非靶向代谢组学技术研究黄芪多糖对热应激奶牛血清代谢组学影响，结果表明，黄芪多糖通过氨基酸代谢、嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢等途径干预奶牛热应激。

赵美雪等采用脂质体仿生膜联合LC-MS技术筛选板蓝根的有效成分，结果显示，精氨酸、胞苷、尿苷、表告依春和腺苷可能是板蓝根产生药效作用的主要成分。

侯宪邦采用LC-MS技术进行板蓝根的血清药物化学研究，结果显示，喹唑酮、色胺酮、异牡荆素、表告依春等4种化学成分可能与板蓝根的抗病毒活性有关。

乔宏兴等采用LC-MS技术分析发酵黄芪代谢产物，筛选到的关键差异代谢物为α-硫酸二乙酯、2-甲基柠檬酸、3-异丙烯基-6-氧代庚酸等。

本次研究中的对差异代谢产物进行KEGG富集分析，发现这些差异代谢产物涉及到精氨酸生物合成、组氨酸和嘌呤衍生生物碱的生物合成等通路。

精氨酸在生命代谢过程中发挥着非常重要的作用，包括在机体内调节生长激素、催乳素和胰岛素等激素的分泌，在机体内参与氨解毒以及参与机体免疫系统的生化反应。

组氨酸是一种组成机体蛋白的氨基酸之一，也是动物合成肌肽和鹅肌肽等功能性二肽的前体物质，对动物的生长尤其重要。

组氨酸作为动物的一种半必需氨基酸，其在体内的供应量与机体蛋白周转具有明显的线性关系，适量的增加可有效提高动物的生产性能和动物机体的抗氧化能力。

生物碱是一种含氮的碱性有机化合物，可有效发挥抗菌、抗病毒和免疫调节等作用。

除此之外，生物碱对于治疗呼吸系统疾病具有非常好的潜力。

本次研究发现经过发酵后的差异代谢产物涉及到的通路可有效提高动物的免疫力、抗氧化能力和生产性能，并且可增强板芪清肺组方防治畜禽呼吸系统疾病的能力。

研究显示发酵后差异代谢产物脂类、酮类等氨基酸显著增加，酸类氨基酸显著降低，涉及到多种氨基酸生物合成和嘌呤代谢等途径，其中精氨酸的生物合成直接影响着板蓝根的清热解毒功效，直接关系这组方发酵后可以发挥更好的药效，后续将结合动物模型血液代谢指标进行进一步确认各代谢差异物的作用。

值得注意的是，发酵后组方中黄曲霉素的含量下调了，这可能解释了发酵炮制可以降低中药材毒副作用。

板芪清肺组方中药材经贝莱斯芽孢杆菌发酵后与非发酵组方中药材的代谢产物存在明显差异，主要原因可能是中药材经贝莱斯芽孢杆菌发酵，菌体产生的纤维素酶等胞外酶可以破碎植物的细胞壁，中药材的药物活性成分和代谢产物释放出来。

与对照组相比，试验采用的LC-MS代谢组学技术充分说明了中药组方发酵后的变化，在固态发酵过程中，使用益生菌不同的情况下会影响药物的代谢途径，也是由于代谢途径的差异使得代谢产物发生变化。

可以猜想代谢途径的差异也可以反过来影响发酵时益生菌的增殖，研究对于发酵中药过程中的作用机制提供了探索方向。