文丨娱圈档案

编辑丨娱圈档案

宿主微生物组在人类的激素产生和随后的生育能力中发挥作用，但这在非模式生物中不太清楚 ，这与基于动物园的保护育种方案中的物种特别相关，因为宿主微生物组组成与生殖输出之间的关系可能允许制定微生物增强策略以提高成功率。

在这里，我们使用 16S rRNA 基因扩增子测序表征繁殖和非繁殖的东部黑犀牛的粪便细菌群落，并通过酶免疫测定定量孕激素和糖皮质激素代谢物浓度以鉴定这种关系。

宿主相关微生物影响多种全生物体功能

微生物组在调节激素和类固醇产生中的作用在人类和模式生物中越来越得到认可，宿主激素不仅塑造宿主微生物组的结构和功能，而且微生物组还可以改变宿主激素的产生和调节，并改变激素相关的宿主基因表达谱。

宿主微生物群与中枢神经系统之间复杂且双向的交流已被确定 ，人类的大量工作特别关注肠道微生物组，肠道微生物组可影响中枢神经系统，反之亦然，因为胃肠道充当中枢神经系统各种通路的支架，感知应激通过下丘脑-垂体-肾上腺轴以糖皮质激素释放的形式诱导化学反应，并且认为细菌对这些生化物质的反应会导致肠道微生物组的改变。

肠道菌群还可以产生内分泌分子，包括生物活性儿茶酚胺，肠道菌群可以降解激素并改变宿主基因表达，从而影响生殖成功，因此，除了参与生殖的生殖和肾上腺激素的良好特征外，宿主微生物组还具有影响个体健康的潜力。

例如， 人类肠道微生物组通过分泌β-葡糖醛酸酶来调节雌激素的产生 ，这些酶使雌激素与下游受体结合，糖皮质激素可以通过特定的人类肠道微生物， 人体肠道微生物组的破坏会导致循环雌激素的变化，而肠道微生物组的操纵可以改变雌激素相关病变的结局。

此外，生殖道的微生物组也会影响人类的一系列妊娠结局，目前正在研究如何操纵微生物组来提高妊娠率和完成到足月。

鉴于宿主微生物群在人类健康和繁殖中的重要性，我们对其他物种的这些关系知之甚少，最近，在非人类和非模式生物中发现了宿主微生物组与激素产生之间的相互作，Noguera等人报道了黄腿鸥胃肠道细菌分类群的丧失，实验性皮质酮水平升高。

Stothart等人表明，较高的粪便糖皮质激素代谢物浓度与野生红松鼠的口腔细菌多样性降低有关，同样，特定细菌属的丰度与自由放养的西部低地大猩猩的粪便糖皮质激素代谢物浓度呈正相关或负相关，与人类一样，这些模式超出了其他物种的肠道微生物组。

根据生殖状态确定了野生狒狒阴道微生物组的显着差异，微生物组在整个卵巢周期中发生了变化，具有特别明显的微生物组，其特征是排卵期间链球菌、毛滴虫、斯内氏菌和双歧杆菌丰度高，然而，这种变化对生殖成功的意义尚不清楚。

宿主微生物群与激素谱之间的相互作用与圈养环境中饲养的动物特别相关， 这些动物在迁地保护计划中起着重要作用 ，优化圈养动物的健康和健康可以最大限度地提高寿命和繁殖产量，从而支持可持续的动物园种群。

东部黑犀牛，激素代谢物和卵巢周期阶段肠道中微生物群的分析

宿主微生物组在人类的激素产生和随后的生育能力中发挥作用，但这在非模式生物中不太清楚，这与基于动物园的保护育种方案中的物种特别相关，因为宿主微生物组组成与生殖输出之间的关系可能允许制定微生物增强策略以提高成功率。

在这里， 我们使用 16S rRNA 基因扩增子测序表征繁殖和非繁殖的东部黑犀牛的粪便细菌群落 ，并通过酶免疫测定定量孕激素和糖皮质激素代谢物浓度以鉴定这种关系。

宿主相关微生物影响多种全生物体功能

微生物组在调节激素和类固醇产生中的作用在人类和模式生物中越来越得到认可 ，宿主激素不仅塑造宿主微生物组的结构和功能，而且微生物组还可以改变宿主激素的产生和调节，并改变激素相关的宿主基因表达谱。

宿主微生物群与中枢神经系统之间复杂且双向的交流已被确定，人类的大量工作特别关注肠道微生物组，肠道微生物组可影响中枢神经系统，反之亦然，因为胃肠道充当中枢神经系统各种通路的支架，感知应激通过下丘脑-垂体-肾上腺轴以糖皮质激素释放的形式诱导化学反应，并且认为细菌对这些生化物质的反应会导致肠道微生物组的改变。

肠道菌群还可以产生内分泌分子，包括生物活性儿茶酚胺，肠道菌群可以降解激素并改变宿主基因表达，从而影响生殖成功， 因此，除了参与生殖的生殖和肾上腺激素的良好特征外，宿主微生物组还具有影响个体健康的潜力 。

例如， 人类肠道微生物组通过分泌β-葡糖醛酸酶来调节雌激素的产生 ，这些酶使雌激素与下游受体结合，糖皮质激素可以通过特定的人类肠道微生物， 人体肠道微生物组的破坏会导致循环雌激素的变化，而肠道微生物组的操纵可以改变雌激素相关病变的结局。

此外， 生殖道的微生物组也会影响人类的一系列妊娠结局 ，目前正在研究如何操纵微生物组来提高妊娠率和完成到足月。

鉴于宿主微生物群在人类健康和繁殖中的重要性，我们对其他物种的这些关系知之甚少，最近，在非人类和非模式生物中发现了宿主微生物组与激素产生之间的相互作，Noguera等人报道了黄腿鸥胃肠道细菌分类群的丧失，实验性皮质酮水平升高。

Stothart等人表明，较高的粪便糖皮质激素代谢物浓度与野生红松鼠的口腔细菌多样性降低有关，同样，特定细菌属的丰度与自由放养的西部低地大猩猩的粪便糖皮质激素代谢物浓度呈正相关或负相关， 与人类一样，这些模式超出了其他物种的肠道微生物组 。

根据生殖状态确定了野生狒狒阴道微生物组的显着差异，微生物组在整个卵巢周期中发生了变化，具有特别明显的微生物组，其特征是排卵期间链球菌、毛滴虫、斯内氏菌和双歧杆菌丰度高，然而，这种变化对生殖成功的意义尚不清楚。

宿主微生物群与激素谱之间的相互作用与圈养环境中饲养的动物特别相关，这些动物在迁地保护计划中起着重要作用，优化圈养动物的健康和健康可以最大限度地提高寿命和繁殖产量，从而支持可持续的动物园种群。

“健康微生物组”对圈养动物的重要性越来越得到认可，尽管其分类学和功能属性的特征仍处于起步阶段，鉴于在圈养收集中成功繁殖的重要性，确定微生物组的组成部分是否与生殖成功的个体有关， 并表征微生物组组成与参与生殖输出的激素之间的关系是有意义的 。

这包括生殖激素以及糖皮质激素。糖皮质激素更常与肾上腺应激反应相关，可能与生殖功能破坏有关;例如，粪便糖皮质激素代谢物浓度的较高变异性与圈养白犀牛， 然而糖皮质激素也被证明对许多动物园动物的正常卵巢功能很重要，包括黑犀牛。

黑犀牛是一个特别有趣的研究系统 ，用于识别肠道微生物群与激素产生之间的关系，由于偷猎角，野生种群受到相当大的威胁，在高度分散的景观中，大约有5000只个体留在野外，其中只有900只东部黑犀牛亚种，

因此，圈养种群对于确保该物种的生存至关重要，从长远来看，为重新引入提供个体，然而，圈养黑犀牛历史上一直遭受由不规则卵巢活动和肥胖引起的低和不一致的生殖输出，此外，气质差异与粪便糖皮质激素代谢物浓度较高有关，尤其是在未生育女性中。

鉴于微生物组组成，激素产生和生殖输出之间的联系，确定与生育能力相关的微生物组成分可能会深入了解调节这种极度濒危物种繁殖成功的机制。

使用圈养黑犀牛的粪便样本，我们使用16S rRNA扩增子测序表征微生物组组成， 并确定与糖皮质激素和孕激素代谢物的关系 ，具体来说，我们测试了以下假设：（i）微生物组组成的差异与犀牛ID，机构，卵巢周期阶段和历史育种成功有关;（ii）微生物组组成因粪便激素代谢物浓度而异;（iii）特定的微生物分类群与育种成功和卵巢周期阶段有关。

研究动物、样本采集和粪便激素代谢物浓度

我们收集了来自三个英国动物学机构的16只雌性东部黑犀牛的数据：Port Lympne Reserve， Chester Zoo（Chester，n = 5）和Howletts野生动物公园， 每个设施还安置了至少一名成年男性，研究个体的年龄从5岁到40岁不等。

个人根据平价进行分类;“非育种”个体在过去7年内从未繁殖或未生产过小牛 ，而“育种”个体在过去7年内生产过小牛，包括在研究期间的某个时候怀孕的个体，该种群的平均产犊间隔为3.5年，因此选择7年作为代表胎次的时期，非经产妇雌性缺乏繁殖以前归因于周期不一致。

从12个月中选择2011-37份粪便样本，此前曾评估过糖皮质激素和孕激素代谢物浓度，粪便样本可提示肠道排出期间循环激素浓度，排便后尽快收集样本并在-<>°C下冷冻，然后运往切斯特动物园进行分析，使用甲醇从匀浆样品中提取粪便糖皮质激素和孕激素代谢物，并使用酶免疫测定法定量，如Edwards等人所述。

而DNA提取和16S rRNA基因扩增子测序 ，是根据Kozich等人和Antwis等人，使用41S rRNA基因扩增子测序分析样品的细菌组成，我们按照制造商的方案使用QIAamp DNA粪便迷你试剂盒提取DNA，并在30°C下额外孵育95分钟，我们纳入了一个空白提取作为阴性对照，一个模拟社区作为阳性对照。

根据Kozich等人的说法，使用双索引正向和反向引物扩增16S rRNA基因的DNA，使用Solis BioDyne 5x HOT FIREPol®混合预混液，2μM引物和1μl样品DNA使用95°C的热循环条件运行PCR一式两份， 持续15分钟;28次循环，95°C持续20秒，50°C持续60秒，72°C持续60秒;并在72°C下最终延伸10分钟。

根据制造商的说明，合并PCR重复并使用HighPrep™ PCR净化珠进行清洁，使用安捷伦 2200 TapeStation 对产品进行质量检查，并在 Qubit™ 3.0 荧光计上进行定量，根据浓度合并样品，以尽量减少测序偏倚，在索尔福德大学的Illumina MiSeq平台上使用配对末端读段（16×2 bp）和v250化学进行2S rRNA基因扩增子测序。

微生物组数据的预处理

我们在RStudio中对R进行了所有分析，我们在DADA16 v2.1.5中处理了0S rRNA基因扩增子序列，测序过程*共中**生成了来自 3 个样品的 208，334，112 个原始序列读数，合并配对端读数后，模态重叠群长度为 253 bp，DADA2在包含20个细菌分离株的测序模拟群落样本中鉴定出20个独特的序列变异。

我们去除了长度>260 bp的序列变异以及阴性对照中发现的嵌合体和两个SV ，所有样本中读数少于100次的SV也被移除，从进一步分析中删除了四个读数数较低的样品，每个样本平均留下22，525个SV。

我们使用 SILVA v128 数据库分配分类法，为了确定测序是否提供了足够的覆盖率，我们使用calculate_rarefaction_curves函数根据丰富度和香农多样性为每个样品构建稀疏曲线，这表明在~48，10个读数上具有良好的覆盖率，我们将最终的SV表，分类表和样本元数据导出到phyloseq包中，以供进一步分析。

为了提供有关未识别SV的更多分类学细节 ，并停止在聚集到给定分类水平的分析过程中去除这些SV，我们使用更高级别的分配将分类表完全注释到物种水平。

微生物组组成与粪便激素代谢物浓度之间的关系

对数孕激素与对数糖皮质激素粪便代谢物浓度呈统计学意义正相关，卵巢周期阶段，但育种不成功对对数孕激素粪便代谢物浓度有显着影响，同样，卵巢周期阶段，但育种不成功对对数糖皮质激素粪便代谢物浓度有显著影响，在这两种情况下，与怀孕相关的样品都显示出较高的代谢物浓度。

在253个细菌属中，我们确定了74个， 对数粪便孕激素代谢物浓度的相关性大于±10.0%和83个属 ，对数粪便糖皮质激素代谢物浓度的相关性大于±10%，尽管这些属没有统计学意义，其中，20±粪便孕激素代谢物浓度的相关性大于0.20%，1个与粪便糖皮质激素代谢物浓度±2%的相关性大于15%。

一般来说， 如果一个微生物属与一种激素呈正相关 ，则该关系与另一种激素也是正相关，反之亦然，在与妊娠和/或产后相关的0个属中，有10属与对数粪便黄体酮代谢物浓度呈正相关，但它们与对数粪便糖皮质激素代谢物浓度的关系变化更大。

然而，与繁殖犀牛和妊娠和/或产后显着相关的四个属（Aerococcaceae，Atopostipes，Carnobacterceae和Solobacterium）也与粪便孕激素代谢物浓度呈正相关，其中两个也与粪便糖皮质激素代谢物浓度呈正相关。

结论

我们根据ID、机构、繁殖成功率和卵巢周期阶段确定了黑犀牛肠道微生物组组成的显着差异 ，特别是，怀孕期间和产后肠道微生物组发生了显着改变，大约三分之一的细菌属与孕激素和/或糖皮质激素浓度显示出超过±10%的相关性。

25个属中有<>个表示卵巢周期的特定阶段和/或繁殖成功，在肠道微生物组中的相对丰度低于平均水平，因此罕见的微生物群似乎与黑犀牛的生殖输出有关，指标分析确定了四个属，它们与育种成功、妊娠和较高激素浓度显著相关，有可能将这些开发成益生菌，以提高黑犀牛在动物园保护育种计划中繁殖的成功率。

参考文献

【1】Huttenhower C， Gevers D， Knight R， Abubucker S， Badger JH， Chinwalla AT， et al.健康人类微生物组的结构、功能和多样性。自然界。2012;486:207–14。

【2】埃文斯，莫里斯，马尔凯西肠道微生物组：虚拟器官在宿主内分泌中的作用。J 内分泌。2013;218：R37–R47。

【3】Sandrini S，Aldriwesh M，Alruways M，Freestone P.微生物内分泌学：肠道微生物组内的宿主 - 细菌通讯。J 内分泌。2015;225：R21–34。

【4】Meddings JB，Swain MG.环境应激诱导的胃肠道通透性由大鼠内源性糖皮质激素介导。胃肠。2000;119:1019–28。

【5】Palme R，Rettenbacher S，Touma C，El-Bahr SM，Möstl E.哺乳动物和鸟类中的应激激素：粪便样本中代谢，排泄和无创测量的比较方面。Ann N Y Acad Sci. 2005;1040：162–71。