文|胡一舸

编辑|胡一舸

前言

丁二酸 是一种四碳二元羧酸类化合物，在食品工业中具有非常重要的作用。丁二酸和它的衍生产品主要用作食物的酸味剂、鲜味剂和乳化剂。

聚丁二酸正丁酯是以丁二酸为原料合成的一种具有良好的可全天然降解性能的高分子，在食品工业中具有广泛的应用前景。

它不止在食物工业中有应用，也被用在制药、化学等领域。而 琥珀酸 的生产方式有很多种，考虑到食品的安全性，在食品工业中使用的大部分都是通过发酵法进行的。

所以发酵法的应用有着非常广泛的市场，而利用可再生的资源进行发酵法的合成，也被视为 最具发展潜力 的一种绿色工艺方式，也是当前的一个热门话题。

钝牙棒杆菌属就是一株由实验室筛选得到的、具有钝牙形、无孢子的革兰阳性细菌，已被大量用于 国产氨基酸 的工业制备。

与氨基酸耗氧发酵工艺相比，钝齿棒杆菌在厌氧环境下转化葡萄糖生产的代谢产物主要为琥珀酸与乳酸，而流向乳酸的碳代谢流量占比在70%。

为此，若要提高该菌在厌氧环境中的丁二酸含量，就必须先降低其产生的乳酸含量。通过对其进行敲除可降低其在细胞内的代谢流量。

基因敲除是一种利用包含一定已知序列的 DNA碎片 与接收者细胞基因组中序列相同或相似的基因进行同源重组，整合到接收者细胞基因组中，从而获得表达的一种 异源DNA导入技术。

以“自杀质粒”为核心的“高效率”的基因改造技术，在上个世纪80年代提出，该技术以 “自杀性”质粒为核心。

在细胞水平上，以“自噬”为核心，将目标基因与“自杀型”DNA进行置换，进而实现“自灭型”的功能改造，并在许多细菌中获得了广泛应用。

为了达到封闭 LdhA基因 的目的，笔者拟采用超高精度DNA聚合酶技术，在钝球菌全基因组范围内，分别从ldhA的上下两个同源重组手臂上和下游两个手臂上。

采用PCR技术，将ldHA基因与耐药基因串联，获得一个完全的打靶序列，并对其进行同源重组和自杀型表达，最终获得ldhA::Kn基因敲除的钝球菌。

研究采用的技术路线

首先利用超级DNA聚合酶法，从钝头棒状杆菌基因组中，将LdhA基因上下两个同源的同源重组手臂进行了 扩增。

由pK18质粒对卡那西林耐药基因（Kn）进行扩增；利用融合PCR技术，将LdhA基因上下两个同源的同源基因与Kn耐药基因 结合。

构建了一个完全的打靶序列，并将该序列序列转入pCVD442中，构建了一个 pCVD442-△LdhA::Kn的打靶序列。

用大肠杆菌beta2155/pCVD442-△LdhA::Kn作为大肠杆菌的供体菌，和卡那霉素培养基中的受体菌株。

通过结合试验，从大肠杆菌中分离得到一株带有靶向质粒的、对卡那霉素耐药的大肠杆菌，命名为 “钝齿棒杆菌”/pCVD442-△LDhA::Kn”。

在含有卡那霉素及蔗糖的LB板上，用钝头棒杆菌/pCVD442-deldhA::Kn克隆菌液划线，进行单克隆的培养。

利用PCR技术，发现了一个LdhA基因替换了Kn抗虫基因，并将其命名为 Pseudomonassp./ΔLdhA::Kn。

引物序列的设计与合成

研究使用的引物序列具体见表1，其中引物对Ldh-5F/Ldh-5R、Ldh-3F/Ldh-3R被用来扩增LdhA基因 上下游同源重组臂。

引物对Ldh-KnF/Ldh-KnR被用来扩增Kn基因，引物对Ldh-5F/Ldh3R被用来进行PCR融合构建 打靶片段△LdhA::Kn。

引物对Ldh-outF/Kn-seqF与Ldh-outR/Kn-seqR、Ldh-outF/Ldh-outR、Ldh-inF/Ldh-inR被用来分别用于重组菌的打靶片段两个端点、打靶片段外部和打靶片段内部PCR鉴别。

LdhA基因上、下游同源重组臂的PCR扩增，钝齿棒杆菌属LdhA基因的上下两个同源重组臂的PCR放大反应系统列于表2中，放大步骤列于表3中。

Kn抗性基因的PCR扩增

用pK18作为模板进行Kn基因的PCR扩增的反应系统见下表4，其步骤类似于下表3。

融合PCR技术构建打靶片段

将Ldh-5F/Ldh-5RPCR产物、Ldh-3F/Ldh-3RPCR产物及Ldh-KnF/Ldh-RPCR产物进行 PCR融合， PCR的反应系统以及反应的步骤见表5和表6。

PCR完成后，用DNA胶进行DNA胶体回收率，得到目标序列，并对目标序列进行序列分析，确定 目标序列的连通性。

打靶质粒的构建

首先，用SmaI限制内切酶对pCVD442质粒进行酶切，在30℃下酶切2小时（反应系统见表7)，完成后，对pCVD442进行琼脂糖电泳和DNA胶的恢复试验，得到了直线的pCVD442质粒DNA。

在16℃下，用 pCVD442质粒酶切产物 和打靶片段△LdhA::Kn（反应系统见表8)，用异丙醇沉淀和70%乙醇洗涤后，用5uL的去离子水中溶出，得到pCVD442-△LdhA::Kn打靶质粒。

同源重组供体菌构建

采用电化学转化法，将pCVD442-deltaLdh::Kn基因转移至E.coliDH5α-lammonium的DH5α-lammoniumpir受体细胞上，并在LB平板上涂覆， 37℃ 下静置。

在3mLLB溶液中，用3mLLB溶液进行体外发酵，分离纯化 pCVD442-deldhA::Kn基因。

利用pCVD442-△LdhA::Kn质粒对E.colibeta-β2155受体细胞进行电化学转化，并在LB平板上覆盖，在37℃下进行体外培养，得到一个单克隆。

LdhA基因敲除菌株构建及筛选

在3mL的BHI介质中，在30℃220rpm下，将受体菌钝牙棒杆菌接种于该介质中一整晚。

在3mLLB的液态介质中，在37℃和220rpm下，将供体菌株 E.colibacillusbacterium/pCVD442-δLdhA::Kn 进行了一次单克隆的免疫处理。

用500微升的供体菌株beta2155/pCVD442-δLdh::Kn菌株溶液和500微升的受体菌株溶液相结合，并进行了接合试验。

将100微升的粘结剂分别涂布在 含卡那霉素的BHI 上，在30℃下进行培养，直到产生了单克隆。

LdhA基因敲除菌株PCR鉴定

从其中，从可以在含有卡那霉素抗性平板上进行生长的钝齿棒杆菌单克隆中，将其插入20μLBHI培养基中，并提取出微量菌液，用打靶序列两个端点两边的引物进行PCR鉴别，其反应体系和程序见表9~10。

经对目标序列两端的PCR扩增后，将其分别在3mLBHI上进行了体外培养，并在 30℃下、220rpm下 进行了体外培养。用10微升的细菌溶液在LB型甘蔗糖片上作标记，然后在30℃下进行培养。

在20uLLB的液体培养液中，用打靶序列的外部和LdhA的内引物进行PCR验证。PCR反应体系和反应程序如表11~13所示。

打靶片段构建结果

首先利用超级DNA聚合酶链反应，从 钝头棒状杆菌中克隆出LdhA基因 上下两个同源的双臂。利用pK18质粒对卡那西环素耐药基因进行了扩增。

采用聚合PCR技术，将LdhA基因上下游同源重组臂与Kn耐药基因相结合，可获得2950bp的全长序列。

构建结果见图1，从 琼脂糖凝胶电泳 检测的结果可以看出，泳道中出现了一条亮丽的条带，并且条带的大小与打靶序列的尺寸一致。

这说明PCR扩增产物是打靶序列，也就是打靶序列△LdhA::Kn构建成功。此外，对该突变体进行了遗传分析，发现该突变体与已有的突变位点相 吻合。

打靶片段两个端点PCR鉴定结果

为了证实该载体与基因组的同源性，以及将LdhA基因置换到Kn基因上，利用该载体的两个端点引物对该载体的PCR结果进行了初步的分析。

前期工作中，通过筛选出24株 卡那霉素耐药菌株， 利用Ldh-outF/Kn-seqF引物，采用双末端PCR技术，对其中24株进行了初步的验证，并获得了初步的验证，结果如图2所示。

电泳结果显示，只有23号泳道出现了明亮的2个条带，且条带大小与目的片段大小相符。

表明第23号克隆两侧均有与预期长度相符的特异性PCR产物，即23号克隆是一次与二次重组成功的克隆。

LdhA基因内部引物鉴定结果

利用Ldh-inF、Ldh-inR引物对，钝齿棒杆菌原株扩增出约200bp的DNA，而LdhA缺失菌不会出现该DNA。

为了进一步确认该菌系23为LdhA基因缺失后的第二次重组克隆菌株，对 经双末端PCR证实为阳性 的第23克隆菌株用LdhA内引物进行扩增，从而确定该菌系23为LdhA的第二次重组克隆。

随机选择23号菌的22个单克隆挑入20μLLB培养基，用 Ldh-inF/R引物 对其进行鉴定，结果如图3所示。

在培养基中，从1到22都未发现条带，而在23的培养基中，原菌在培养基中有明显的条带，并且条带的尺寸与目标物一致。结果显示，1-22个无性系为LdhA基因缺失后的第二次重组菌。

打靶片段外侧引物鉴定结果

在Ldh-outF和Ldh-outR两个引物中，LdhA被Kn耐药基因替换后，扩增到3113bp。打靶片段外部引物PCR（图4）表明，一条亮带子在 约3000bp处 呈现，且其尺寸与目标片段一致。

通过对LdhA基因进行序列分析，发现LdhA基因已被Kn基因所取代，并得到LdhA基因缺失的目标菌株-钝齿棒杆菌属 （LdhA::Kn)/ΔLdhA::Kn。

乳酸脱氢酶酶活力检测结果

根据已有的技术方案，通过对LdhA基因进行 同源重组， 使LdhA基因被Kn耐药基因所取代，从而使LdhA基因不能正常表达并产生LDH。

乳酸脱氢酶酶活性检测结果（表14）表明，原始菌细胞提取液每克蛋白质的乳酸脱氢酶酶活性为0.64U。

而钝齿棒杆菌/ΔLdhA::Kn的细胞提取液没有检测到乳酸脱氢酶酶活性，这进一步证实了 钝齿棒杆菌LdhA基因敲除成功。

结论

利用同源重组来代替目标基因，这是一种常见的编辑微生物基因组的技术，它可以被分成两种情形：

一种是在目标基因中嵌入异源基因，从而 打破目标基因的整个编码盒， 并已经被成功地应用到了谷氨酸棒杆菌LdhA基因的敲除上。

但是该基因碎片仍然留在基因组中，在经过了几个不同的传代之后，有可能会发生回复现象。

二是采用外源基因彻底取代靶基因，使靶基因彻底消失，这一技术也被广泛应用。

目前，尽管利用融合PCR技术已经成功地获得了钝头菌LdhA的缺失突变体，但对于该突变体LdhA的缺失却鲜有报道。

本项目拟在前期工作基础上，利用LdhA基因在钝齿棒杆菌*特中**异表达，利用PCR技术，在其上下游分别与 耐药基因和耐药基因序列 进行序列比对，获得耐药基因编码基因。

并利用该基因编码的同源重组质粒pCVD442和同源重组供体大肠杆菌，进而从钝齿棒杆菌属中分离纯化出一种耐药基因。

并对其进行多重PCR和LDH活性测定，发现该基因在钝齿杆菌属中已被特意地敲除掉，并在此基础上进一步验证该基因的功能。

本项目拟对该基因编码蛋白进行功能验证，以明确其功能。与此类似，采用融合PCR技术敲除谷氨酸酸棒杆菌Ldh后， Ldh基因在突变体中的相对表达率为0， 说明该技术可以被应用于棒状杆菌胞内Ldh的缺失。

该项目的实施将为钝头芽孢杆菌的遗传改造及进一步高效生产丁二酸的应用打下坚实的理论基础。

本项目拟在此基础上，进一步开展该菌/ΔLdhA::Kn发酵生产丁二酸的技术路线的探索。

参考文献：

[1]姚玉静，崔春，邱礼平，等《食品蛋白质的化学改性研究进展》

[2]戴霈，戴蕴青，陈敏《辛烯基琥珀酸酯化淀粉的乳化性质研究》

[3]陈琦，李玲阁《产L-谷氨酸细菌AS1.542菌株的研究Ⅰ.AS1.542菌株的鉴定》

[4]赵芹芹，罗玉常，窦文芳，等《钝齿棒杆菌的代谢改造：L-鸟氨酸与L-瓜氨酸合成菌株的构建》