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角膜移植是角膜缺损最有效的临床方法，但它需要精确尺寸的供体角膜、外科缝线等技术挑战。术后患者可能会出现移植排斥反应和缝合引起的并发症。开发能够长期与角膜组织结合并有效修复局部角膜损伤的眼用胶具有极高的临床意义。
中山大学袁进、白莹团队 通过非竞争性双交联工艺开发了由猪脱细胞角膜基质（pDCSM）和甲基丙烯酸透明质酸（HAMA）组成的混合水凝胶，可以填充各种形状的角膜缺损。更重要的是，通过在水凝胶和邻近组织之间形成互穿网络和稳定的酰胺键，水凝胶表现出优异的粘附性能，以实现无缝合修复。该组合水凝胶极大地改善了HAMA的不良细胞粘附性能，支持了角膜细胞的存活、增殖和角膜细胞表型维持。相关工作以“ Dual-crosslinked regenerative hydrogel for sutureless long-term repair of corneal defect ”为题发表于 Bioactive Materials 。
双交联水凝胶的制备: HA用甲基丙烯酸酐预*能官**化，使得所得HAMA可以在光引发剂LAP存在下进行光交联。同时，pDCSM-G可单独通过CMC/NHS进行化学交联。为了通过形成互穿网络获得更坚固的混合水凝胶系统，将HAMA和pDCSM预凝胶溶液与额外的LAP和CMC/NHS预混合，同时诱导两种交联模式，以获得具有优异分子间相容性的双交联混合水凝胶。
图1 水凝胶的应用、合成和生物分子组成
理化性能研究：维持高角膜透明度在眼科治疗中至关重要。化学交联的水凝胶，包括光交联HAMA（1%，w/v）、CMC/NHS交联pDCSM-G（3%，w/v）和双交联混合水凝胶均显示出优异的透明度，透光率在可见光波长范围内（380-800nm）均高于80%。但需要注意的是，不含CMC/NHS的pDCSM预凝胶溶液在室温下通过β折叠及和其他物理交联机制自发物理凝胶化相对不透明。溶胀率和酶降解是评价水凝胶形状和结构稳定性的关键指标。溶胀表征表明，一旦含有CMC/NHS的pDCSM-G整合到HAMA中进行双交联后，杂化水凝胶的溶胀效应显著减轻。溶胀比随着水凝胶中pDCSM组分的增加而降低，这归因于较高的交联密度。在该研究中，双交联C3H1水凝胶达到了最小的溶胀比。类似的趋势在存在I型胶原酶的降解评估中也很明显。C3H1水凝胶在降解8周后保留了超过70%的原始质量和初始盘形。相反，CMC/NHS交联的pDCSM-G降解速度远快于混合水凝胶和1%的HAMA。HAMA网络的整合显著改善了混合水凝胶的组成和结构稳定性，这意味着双交联水凝胶可以在角膜缺损中提供长期保留。最后，双交联水凝胶具有增强的力学性能，光暴露1分钟后，C3H1水凝胶的最终储能模量（G’=4326±73 Pa）大于1%HAMA水凝胶（G’=3131±101 Pa）和3%pDCSM-G（G’＝3073±195 Pa）。
图2 水凝胶处理角膜的术后观察
体外细胞学研究：在HAMA水凝胶上也很少发现上皮细胞和角膜基质细胞黏附增殖，而C3H1水凝胶支持上皮细胞和原代角膜基质细胞的粘附。C3H1水凝胶上的细胞的活力与在pDCSM-G和TCP上培养的其他细胞的活力相近。此外，qRT-PCR结果显示，与在TCP上培养的相比，C3H1水凝胶上角膜基质细胞的角蛋白聚糖和卢米康的表达明显更高，但肌成纤维细胞相关基因COL1A1、COL3A1、ACTA2和TGF-β1的表达相对较低。 证实双交联C3H1水凝胶中的pDCSM组分赋予混合水凝胶优异的生物相容性，促进细胞粘附、存活和增殖，并有助于维持角膜细胞表型。
图3 水凝胶处理的兔角膜术后8周的组织学分析
角膜修复研究：在为期八周的体内评估中，填充有双交联水凝胶的实验组眼睛保持透明，紧密粘附在基质床上，并具有长期保留，上皮层和基质的厚度分别与天然角膜的厚度相当。pDCSM-G组降解过快，而双交联凝胶能够显著地长期保持稳定。在减少角膜瘢痕形成、加速角膜上皮和基质伤口愈合方面表现出优异的性能。作为一种填充生物材料和生物活性密封剂，双交联杂化水凝胶在未来的生物医学应用中具有长期修复角膜缺损的巨大前景。
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