1、前言
鼻炎已然成为一个全球性的健康问题，患病率逐年上升，影响着全世界许多患者生活质量。鼻炎可分为感染性鼻炎、过敏性鼻炎和非过敏性非感染性鼻炎。目前临床上诊断不同类型鼻炎主要是根据临床诊断，结合病史、症状、体征、鼻内镜检查、影像学检查和过敏原的检查等来进行诊断和鉴别诊断。除鼻细胞学外，目前尚缺乏可辅助诊断鼻炎的客观局部炎症指标。通过检测鼻细胞学，可以在感染性鼻炎患者鼻分泌物中观察到大量的中性粒细胞浸润，AR患者鼻分泌物中通常会观察到嗜酸粒细胞。
尽管鼻细胞学检查可用于辅助不同类型鼻炎的诊断，但由于取样方法的差异、操作程序的复杂性以及临床上缺乏统一的诊断标准，此方法仍未广泛用于临床实践。在不同类型鼻炎的病理过程中，除炎症细胞的参与外，还有大量的细胞因子、趋化因子、炎症介质和神经因子等参与疾病的发生与发展。这些也都成为了可以辅助诊断和区分不同类型鼻炎的潜在客观局部指标。目前已发现鼻分泌物中细胞因子，例如白细胞介素、IL-5、IL-6和IL-8以及炎症介质，如嗜酸粒细胞阳离子蛋白、嗜酸粒细胞趋化因子和髓过氧化物酶的浓度在不同类型鼻炎和不同严重程度的鼻炎中存在差异。
提示了检测鼻腔分泌物中的生物标志物有助于辅助诊断局部鼻腔炎症。然而，目前还没有可用于常规临床实践的客观生物标志物。一方面是因为取样方式的不一致性以及检测方法的不同导致结果不稳定。另一方面是检测这些指标通常需要配备精密的检测仪器，如酶标仪等。所以标准化的取样流程以及更简便的检测方式成为研究重点。
本课题首先检测与分析了健康对照与AR患者鼻黏膜的差异基因，筛选出潜在的差异基因，分析这些因子在鼻分泌物中的浓度差异及其辅助诊断的价值。
其次，因在日常的诊疗过程中发现儿童不同类型的鼻炎，如急性鼻炎、慢性鼻窦炎、CRS伴过敏和AR在症状上表现类似，不易区分。
在这一部分，首先检测分析了HC，AR与CRS患者的鼻黏膜差异基因，结合文献及预实验筛选出不同因子，分析这些因子在区分儿童不同类型鼻炎中的价值。
最后，因前期的研究结果发现患者鼻分泌物中ECP和MPO浓度高，且与HC有较大的区分度。这一特性可制成胶体金，以实现临床快速诊断。因此，本研究还检测并分析不同鼻细胞学类型鼻炎中ECP和MPO浓度及其与细胞学的相关性，分别以酶联免疫吸附剂测定法和胶体金法检测鼻分泌物中ECP和MPO浓度；分析ECP联合MPO在辅助诊断不同类型鼻腔炎症的临床价值。以评估ECP/MPO胶体金试纸条在临床上推广应用的潜力与价值。
2、引言
目前临床上诊断AR主要是依据病史、鼻高反应性症状、鼻内镜检查结果和过敏原检查等进行，尚无广泛应用于临床的客观指标。在AR的病理机制中有多种炎症细胞和细胞因子等的参与。这些均具有成为辅助诊断的客观标志物的潜力。鼻细胞学是目前较为认可的客观辅助诊断以及指导后续治疗的指标，但其由于取样方式的不确定，操作流程复杂和需要完备的实验条件，同时没有统一的诊断标准，使其没有广泛应用于临床。ECP可由活化的嗜酸粒细胞分泌，是EOS活化的特征性炎症介质。已有研究证实ECP作为局部客观指标在辅助诊断AR上具有一定价值。在这一部分研究中，首先分析比较AR与健康对照鼻黏膜RNAseq结果，分析差异最大的前25位基因。通过查阅文献以及预实验结果，发现骨膜蛋白具有潜在辅助诊断AR的价值。
因此，本实验通过检测AR患者和健康对照的鼻分泌物中鼻细胞学、ECP和骨膜蛋白浓度，分析比较这三种因子在AR与健康对照浓度差异以及三者的相关性。同时绘制ECP、骨膜蛋白和ECP联合骨膜蛋白辅助诊断AR的受试者工作曲线，确定其辅助诊断AR价值。
材料与方法
AR的诊断基于2008年ARIA的标准[1]，即：1）具有两种或者两种以上典型的鼻部症状（鼻塞、鼻痒、鼻漏和喷嚏）；2）皮肤点刺试验阳性（出现大于3mm的风团表示皮肤反应阳性，本试验包含9种特定的变应原，包括粉尘螨、屋尘螨、艾蒿、豚草、树花粉混合物、霉菌混合物、猫和狗的毛发和蟑螂）和/或血清特异性免疫球蛋白E呈现阳性结果（与上述类似的过敏原，sIgE水平高于0.35KU/L认为是阳性结果）。排除CRS伴/不伴鼻息肉患者；入组前1年内进行过任何鼻部手术；研究入组前4周内有呼吸道感染；鼻部肿瘤的参与者。同时排除在研究入组前2周内使用口服/鼻喷糖皮质激素、抗生素、口服/鼻喷抗组胺药、白三烯或减充血剂的患者。
健康对照
纳入没有鼻塞、鼻痒、鼻漏或喷嚏等鼻部症状的志愿者；没有鼻部疾病或过敏史；并且在研究入组前4周内没有任何呼吸道感染的健康人；血清sIgE阴性。
实验方法
鼻黏膜上皮的收集采用中耳刮匙。将刮匙置于180℃烤箱干烤6h灭酶灭菌后常温冷却备用。采样前嘱志愿者擤干净鼻涕后，用中耳刮匙轻轻刮取患者左右鼻子下鼻甲粘膜，取豌豆大小，取完后立即保存至预先装有1mLtrizol中，标记好日期姓名之后立即冻于液氮。待所有的样本全部收集完成，交由公司进行RNAseq检测。RNAseq实验、高通量测序和数据分析均由武汉康测科技有限公司进行。步骤简述如下：参照Chomczynski等人的方法从收集到的鼻黏膜中提取总RNA。DNaseI提取RNA之后消化DNA。样本质量分析由NanodropTMOneC分光光度计通过检测A260/A280进行。合格的样本最后通过Qubit3.0和QubitTMRNA广谱检测试剂盒进行定量。原始数据首先是由Trimomatic（version0.36）过滤。通过featureCounts计数，然后计算RPKM。用edgeR包（version3.12.1）鉴定组间差异表达的基因。
基本信息收集
纳入的患者在治疗前完成视觉模拟评分及鼻部症状评分。（1）VAS评分：评分采用100分制，患者对就诊前一周鼻炎发作的严重程度打分。0分表示没有不适，对日常及工作完全没有影响。100分表示完全不能忍受，鼻炎所造成的困扰已严重影响日常生活、睡眠等。分数越高则代表鼻炎对患者造成的困扰越大，越不能忍受。
（2）鼻部症状评分：采用分级打分制，即0-3分制。患者自就诊日期前7天内，依据鼻炎发作时候鼻部症状严重的程度，对鼻塞、鼻痒、鼻漏、喷嚏每一项分别进行打分，最后计算总和。按以下打分制计算：1）无=0；2）轻度=1；3）中度=2；4）重度=3。此部分需耐心与患者解释，以确保收集到的患者的症状评分真实性。记录每位入组患者单独的4个症状评分后，计算鼻部症状评分总分（TotalNasalSymptomScore，TNSS），TNSS即四个鼻部症状的评分相加的总和。同时记录下患者年龄、发病时长、是否合并哮喘以及一年中鼻炎发作是否超过90天的结果。
鼻细胞学的收集及保存
本实验参照Chen的方法学收集鼻细胞涂片[3]。患者入组后嘱患者擤鼻子或者用 小玻璃棒（经过75%酒精消毒后使用）轻轻伸入鼻腔中，在鼻腔中旋转以获得鼻腔前 部的鼻腔分泌物，此过程要轻柔，避免刺激鼻腔黏膜。将玻璃棒收集到的鼻腔分泌物 均匀且薄薄地涂在载玻片上，需要铺满整张玻片的至少2/3面积。待玻片自然风干后 或者吹风机冷风吹干之后，进行染色。
瑞氏-吉姆萨染色
先用胶头滴管吸取染色试剂盒中的A液，滴5滴于涂布有细胞学的载玻片上，轻 轻摇晃玻片，让染色液均匀的铺满整张玻片，计时20秒后，立即吸取B液，滴10滴 （2倍液体量）于载玻片上，轻轻摇晃混匀。待计时器显示至2min时，以细小水流冲 洗玻片30s。冲干净之后待其自然风干，或者吹风机冷风吹干后在光学显微镜下观察。
3、讨论
本研究首先检测与分析AR患者与健康对照鼻黏膜上皮RNAseq结果，筛选出潜 在的差异基因POSTN，其编码的蛋白为骨膜蛋白。在此基础上，又收集AR与健康对 照鼻分泌物和症状评分，来评估三种客观指标（EOS指数、ECP和骨膜蛋白）在辅助 AR诊断方面的临床价值。结果发现骨膜蛋白和ECP单独作为客观指标具有较好的辅 助诊断价值，两者联合辅助诊断AR可以达到很高的临床诊断灵敏度与特异度。但上述因子在鼻分泌物中的浓度高低尚不能反应患者临床症状严重程度。
如前述及，目前在临床上，对AR的诊断主要依靠疾病病史、鼻高反应性症状以 及过敏原结果来进行诊断，尚无广泛应用的客观指标可以辅助诊断，且这些依据并不 足以反映AR患者的具体炎症程度。由于AR是典型的以IgE及Th2介导的过敏 反应，许多学者对AR患者的全身及局部炎症标志物进行了研究：如Chen ST等人分 析了血浆中IgE，ECP及EOS%与AR症状严重程度相关性。
Klemens C等人对 比分析健康对照和AR患者鼻分泌中的炎症介质和细胞因子，结果提示AR患者鼻分 泌物中类胰蛋白酶、IL-5和ECP升高。König等人则对比健康对照、常年性和季节 性AR患者鼻分泌物中不同炎症因子，结果发现持续性及季节性AR患者鼻分泌中 ECP，类胰蛋白酶，单核细胞趋化蛋白1和巨噬细胞炎症蛋白1β高于健康对照。由于 AR的炎症反应主要集中在鼻粘膜局部，因此局部的炎症标志物及其变化，较全身的 炎症标志物更为敏感。我们之前的研究也发现，局部嗜酸粒细胞百分比及ECP表达较 血液中嗜酸粒细胞百分比及ECP在AR的诊断中价值更高。
4、结论
IL-6在急性鼻炎中升高。IL-8和MPO在CRS伴过敏，CRS及急性鼻炎中升高。 ECP在AR、CRS伴过敏、CRS和急性鼻炎中不同程度升高，不具备区分度。骨膜蛋 白在AR患者明显升高。上述因子结合分析可明显区分出AR患者。