前言

你敢信，猪竟然可以列入保护名录！

不要怀疑，因为外国*猪种**的入侵，安徽皖南花猪受到影响，目前已经是安徽当地保护名录的一员。

要知道这款猪距今已经有500年的历史，因为它论是繁殖率还是低于动物疫病上或者说是品质都是优良的存在，所以一直保留至今。

而我国自古以来对于猪肉的需求量都是很大的。

它的繁殖率和抗病率在某种程度上可以缓解国内市场对于猪肉的需要。

不过就算是有一定抗病率的皖南花猪，都会因为病毒的入侵，造成大批量的死亡。

如何可以提高猪的抗病率，减少猪患病概率，成为很多学者研究的目标。

一、病原菌对猪的影响

皖南花猪原产于安徽省南部的黄山市，已列入安徽省地方畜禽品种保护名录， 其主要特点是耐粗饲，繁殖性能好，肉质优良，具有良好的市场前景。

但近年来受到国外猪种的冲击， 我国本地猪种逐渐减少，给当地猪种的保种工作带来很大难度。

控制并摧毁病原菌已经变成了目前在养猪业中进行的一项重要工作。

在大型猪场中，病原菌的数目很多，而且感染的状况非常复杂，这些病原菌既可以是单个的，也可以是组合的，有的还会跟某种病毒进行组合。

在这种组合中，多种不同的细菌被组合在一起的现象非常常见，经常会因为一种细菌在被一种细菌感染后，会造成猪的身体抵抗力降低。

同时由于受到了一种细菌的影响，造成了猪群体的二次感染，造成了猪群体的疾病进一步的恶化。

从而造成了疫情在短时间内很难控制住，发病率、死亡率都会显著地提高，这就给大规模猪场的疫病防治带来了困难。

16SrRNA是目前最有效、最广泛使用的一种分子时钟，16SrRNA包含一个可变区和一个恒定区，在不同的细菌中，16SrRNA存在着一定的可变区，而恒定区则相对稳定。

根据恒定区内的可变区，可以设计引物进行16SrRNA的扩增，从而根据16SrRNA的可变区对不同的细菌进行区分。

从而使16SrRNA在不同的菌种间存在着一定的差别，并且可以采用测序技术进行序列测定，从而为细菌学和分类学家所认可。

二、样本来源

有学者专门从黄山市歙县“皖南华猪保种”中心的疫病猪群中采集鼻咽拭子， 从其心脏和肝脏等脏器中提取出一株纯菌，并将其置于-20℃的低温贮藏，以待研究。

FTC41H2DPCR,GSG-2000核酸胶体图像分析管理系统，DYY_8C电泳仪。黄山大学生命与环境科学研究院的微生物学实验室为金黄色葡萄球菌提供了检测结果。

引物合成参照文献报道的通用引物序列（见表1)，由上海生物工程有限公司合成。

将lmL过夜培养的细菌培养物以8000r/min的速度进行离心1min，然后将上清丢弃，将菌体细胞采集起来，经过水浴裂解、去蛋白、异丙醇沉淀等工序。

从1mL过夜培养菌液中得到10~30juugDNA。具体的操作流程依照细菌DNA提取试剂盒的说明书来进行。将提取出来的DNA-201放入冰箱中，以备不时之需。

用2xTaqMix25jui、16s-Tl和16S-T2为引物，利用一般引物构建50μLPCR系统，引物2µL，引物2µL和基因组DNA4漏斗，PCR系统在951pH值下完成50µLPCR。

三、PCR产物测序

PCR结果被送往上海生化科技股份有限公司，对其进行了二次测序，并对其进行了二次测序，最终得到了16SrRNA的扩增序列。

在NCBI的网页上，可以找到BLAST在线比对软件，然后可以选择Nucleotidecolltction（nr/nt）数据库，然后运行BLAST程序，就可以得到与该菌16SrRNA基因序列同源的序列以及相应的细菌名称了。

用Genetic引物进行PCR，得到了1500bP的目标序列。电泳结果见图1，Genetic引物特异性好，条带清晰，无杂带，无明显的尾巴。

使用Chromas软件，打开测序的峰图Abl，选择峰图中不同波形无交迭，波形无钝化的波形，最终得到约440bP的测序数据峰图，如图2所示。

在3'末端与5'末端的差异被剔除后，采用ClustalX与DNAMAN对70-800bP的序列进行了同源对比，得到了如图3所示的同源对比结果。

将已知的待检菌株导入NCBI数据库，通过对其进行联机BLAST，得到的联机结果中，E值均为0，表明待检菌株和已知的病原菌之间存在一定的偶联关系。

E值较低表明待检菌株和已知病原菌之间存在一定的偶联关系，Idem从99%开始下降，MaxScore从2712开始下降（图4A)。

四、516SrRNA基因序列进化树分析

鉴于待检序列是1500bp的16SrRNA，又是从动物中获得的病原菌，所以，我们最终还是决定先进行一份检测。

利用MEGA分析方法， 对被检测的16SrRNA基因进行了演化分析， 得到了一个由16SrRNA基因组成的演化树形。

其中，横向表示了各序列之间的差别，纵向表示了演化树形成的速率。

学者从皖南华猪繁育中心收集了20个菌种， 对8个菌种进行了全基因组测序，剔除了重复的菌种和未完成的菌种后，得到了8个菌。

包括鲍曼不动杆菌，枯草芽抱杆菌，病疾志贺菌，猪葡萄球菌，大肠埃希氏菌，赌博样芽胞杆菌等。

此外，4种朱菌与数据库中登记的DNA的相似性达到98%，已经确定了一个属， 参照菌为克雷伯氏菌8种菌中，枯草杆菌、蜡样芽胞杆菌、猪葡萄球菌等为革兰氏菌 ，其他菌为革兰氏菌。

虽然革兰氏菌的数量很多，但是通过对8种菌的革兰氏菌的检测，仅通过革兰氏染色就可以确定它们属于何种菌。

因此，仅通过革兰氏染色就可以确定它们属于何种菌。 而对它们的鉴别应该根据它们的测序来确定它们属于何种菌，并根据它们的16SrRNA基因进行了系统演化，得到了与上述研究结论相符的结论。

经过对皖南花猪进行了采样，得到了大量的病原菌，并没有在皖南花猪的种类中找到了一些重要的病原菌。

总体来看，这些病原菌的生长状况都很好，这可能与当地的皖南花猪对疾病的抵抗力很高有关，但是，养殖环境的清洁和疾病的预防还是要做好的。

16SrRNA测序法是指在16SrRNA的保守区上，利用一般PCR的方式，将16SrRNA的基因序列进行扩增。

并在此基础上，利用16SrRNA的可变区的差异，来判断各种细菌的演化距离，并判断它们的亲缘关系，进而将它们进行分类。

因此，16SrRNA-seq技术具有简单、快速的优点， 它可以利用一个普通的引物同时进行多个基因的扩增，具有高通量、高效率的优点。

与之形成鲜明对比的是，在实验室里，从从细菌的分离纯化到生理生化的一整套实验方法，都存在着一些缺点。

例如，邱吉宇等利用16SrRNA-seq技术在贵州的一个蜂场里，对一例细菌性的中蜂进行了鉴别。赵全邦等利用16SrRNA-seq技术对蜱类进行鉴别，同时对它们的系统进化进行研究。

通过16SrRNA-seq技术，对我国皖南花猪的致病菌进行快速、准确的检测，从而更好的了解我国皖南花猪的致病菌种类和数量，为我国皖南花猪致病菌的预防和保护提供科学依据。

结语

在信息时代的发展过程中，核糖体的资料库得到了进一步的改进，现已创建了16SrRNA专有资料库。

以SILVA为最受欢迎，紧随其后的是GREENGENE，它的资料库也是由RPD官方网站所提供的。

此外，NCBI还为16SrRNA的人类校正数据库，16SrRNA的测序技术在识别和分类等方面有着巨大的潜力。

可以预见的是，16SrRNA的测序技术的广泛应用，对于流行病的研究和分析有着巨大的作用。

参考文献：

[1]李小金，钱坤，刘林清，等《皖南花猪与大约克猪胴体及肉质性状比较研究》

[2]王德青，唐鑫生，黄松，等《皖南花猪种质资源保护现状与开发利用对策》

[3]洪云华《皖南花猪资源现状及存在问题与对策》

[4]郭龙,汤细彪，尚书，等《2010年猪群常见细菌性疫病的分离鉴定与流行病学分析》

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