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河口是发生潮汐和咸淡水交汇的重要地带，其盐度变化剧烈。因贝类迁移能力有限，盐度变化对它们的生理影响很大，会导致其在河口地区分布范围逐渐萎缩，资源量大幅度下降。高渗或低渗等环境胁迫会直接引起生活在河口地区的贝类体内渗透变化及氧化应激等生理反应。

Na+/ K+-ATP酶是钠离子(Na+) -钾离子(K+) 泵的重要活性成分，在维持动物体细胞内外离子平衡方面起着重要作用，其水平常作为动物渗透压调节能力的一个重要指标。超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 等自由基清除酶是生物体抗氧化酶系统的重要组成部分，在水生动物的免疫系统中发挥重要作用，也是评估生物受环境影响的有效指标。一些学者以SOD、CAT、GSH-Px、Na+/ K+-ATP酶或丙二醛 (MDA) 等指标研究了缢蛏 (Sinonovacula constricta) 、泥蚶 (Tegillarca granosa) 和文蛤 (Meretrix meretrix)等河口双壳类对盐度的生理应激反应。

彩虹明樱蛤 (Moerella iridescens) 隶属软体动物门 (Mollusca) ,双壳纲 (Bivalvia) ,帘蛤目 (Venerida) ,樱蛤科(Tellinidae),俗称梅蛤、扁蛤、海瓜子等，为小型滩涂经济贝类，主要分布于我国长江口以南浙江沿岸的沿海地区，是长江口潮间带底栖动物群落优势种。因味道鲜美而深受消费者喜爱。目前，有关彩虹明樱蛤的研究主要集中在养殖技术、重金属和消毒剂等污染物对其的急性毒性作用、环境因子对其发育阶段的影响、群体形态差异及遗传多样性等方面，而有关盐度对彩虹明樱蛤存活和酶活性的影响研究鲜见报道。本研究开展了急性盐度胁迫对彩虹明樱蛤的成活率、抗氧化和渗透压调节能力等方面的实验，以期为探索彩虹明樱蛤对盐度的适应能力和调节机制及为其养殖和保育提供前期数据和基础理论。

材料与方法

实验材料

实验用彩虹明樱蛤购于上海市浦东新区芦潮港水产市场，挑选健康、活力强的彩虹明樱蛤，平均壳长 (17.37±0.36)mm, 壳高 (11.49±0.26)mm, 壳宽 (5.23±0.12)mm, 体质量 (0.52±0.02)g。将其暂养于上海海洋大学公共实验室的蓝色塑料箱 (长800mm×宽650mm×高500mm) 中7d, 暂养条件：水温 (17±1)℃、盐度 18±1 ,保持连续充气，期间每天全量换水，投喂角毛藻 (Chaetoceros sp.) (浓度1.0×105个·mL-1),实验用水为海水晶和曝气自来水配置的海水，使用手持式光学盐度计(拓赫YH-S)测定盐度。

实验设计

经预实验采用等对数间距法设置10个盐度实验组：5、6、8、11、14、18、23、30、39、50,每组3个平行，每个平行20只彩虹明樱蛤。每24h全量换水，换水后维持盐度不变。分别在24、48、72h和96h观察实验组贝的活力，统计死亡个体数，并及时取出死亡个体，防止水质腐败。实验贝死亡特征判断：双壳张开无法自己闭合，水管和斧足均伸于体外，用镊子刺激时无反应。

根据实验用贝来源、文献记载及本文急性胁迫预实验结果，设置5个盐度处理组(盐度6、12、18、24、30),以彩虹明樱蛤自然生活水域盐度18为对照组，每个盐度组设置3个平行，每个平行50只试验贝。实验开始前48h停止投喂角毛藻，开始后分别在实验进行的0、24、48、72、96h取样，用经高压蒸汽灭菌(121℃,15min)后的解剖刀在实验台上分别挑取每个平行组中30只贝的鳃和消化腺混合均匀，并用液氮冷冻后置于-20℃冰箱保存，用于SOD、CAT、GSH-Px和 Na+/ K+-ATP 酶以及总蛋白浓度的测定。

酶活性测定

取各组样品约200mg置于冰浴中的离心管， 再加入9倍体积 (W/V) 预冷的生理盐水，用全自动样品快速研磨仪(CBFSTPRP-32 上海)将组织均浆，然后分装于5mL的离心管中，离心10min, 所得上清液收集于1.5mL离心管后立即检测。总蛋白采用考马斯亮兰法(南京建成试剂盒)测定，SOD、CAT、GSH-Px和Na+/ K+-ATP 酶的检测方法均参考南京建成科技有限公司试剂盒说明书操作。

数据分析方法

实验数据采用SPSS25.0 和Excel2016软件进行统计分析及图表绘制，在正态分布和齐次性检验后用单因素方差分析 (one-way ANOVA) 中Duncan检验确定各处理组间的差异显著性，差异显著水平设置为P<0.05。

结果与分析

盐度胁迫对彩虹明樱蛤死亡率的影响

除8～18之间的4个盐度组死亡率为0外，其他各盐度组24 h的死亡率均不超过1.67%;48 h盐度50组死亡率达40%,其他盐度组的死亡率均低于3.33%;随着暴露时间的增加，盐度39和盐度50组死亡率急剧增加，96h时盐度50组死亡率为100%,盐度39、30、23、6、5组死亡率分别为43.3%、6.7%、3.3%、1.7%、8.3%。

盐度胁迫对彩虹明樱蛤酶活性的影响

SOD活性

在盐度6、12、24、30胁迫下，彩虹明樱蛤鳃和消化腺SOD活性均随暴露时间延长呈现先升高后下降趋势，对照组鳃SOD活性呈现先下降后升高趋势、消化腺SOD活性无明显变化 。

在鳃SOD活性方面，24h, 最高盐度30组SOD活性显著高于盐度6、12和24组 (P<0.05),而后3组显著高于对照组(P<0.05);48h, 最低盐度6组SOD活性显著高于对照组和盐度12、24和30组 (P<0.05),后3组显著高于对照组 (P<0.05);72h, 最低盐度6组SOD活性显著高于盐度12组 (P<0.05),盐度12组显著高于对照组 (P<0.05),对照组显著高于盐度24和30组 (P<0.05);96h, 盐度12组显著高于盐度6、18、24、30组 (P<0.05),对照组和盐度30组显著高于盐度6组 (P<0.05) 。

CAT活性

在盐度6、12、24、30处理下，彩虹明樱蛤鳃和消化腺CAT活性均随暴露时间的延长呈现先升高后下降趋势，对照组鳃CAT活性呈逐渐下降趋势、消化腺CAT活性从开始到48 h无显著变化，之后随暴露时间延伸显著下降后再显著上升 。

处理24h, 鳃CAT活性最高盐度30组显著高于盐度6和12组(P<0.05) ,最低盐度6和12组显著高于盐度24组(P<0.05) ,盐度24组又显著高于对照组(P<0.05) ;48h, CAT活性按盐度30、6、24、12、对照组的顺序依次显著降低(P<0.05);72 h, 最低盐度6组显著高于盐度12、对照、24和30组 (P<0.05);96h, 最低盐度6组显著高于盐度12组和对照组(P<0.05),对照组、盐度24和30组显著高于盐度12组 (P<0.05)。

处理24h, 消化腺CAT活性盐度12、24和30组显著高于盐度6和对照组 (P<0.05);48 h, 最低盐度6和12组显著高于盐度24、30和对照组 (P<0.05);72h, 最低盐度6和30组显著高于对照组和盐度24组(P<0.05),对照组和盐度24组又显著高于盐度12组(P<0.05);96h, 最高盐度30组显著高于盐度6组和对照组 (P<0.05),与盐度12和24组无显著差异(P>0.05)。

GSH-Px活性

在盐度6、12、24、30胁迫下，彩虹明樱蛤鳃和消化腺GSH-Px活性均随暴露时间的延长总体呈现先升后降的趋势，但胁迫后期一些盐度组的GSH-Px活性又稍有上升；对照组鳃GSH-Px活性呈先升高后下降的趋势，而消化腺GSH-Px随暴露时间延长无显著变化 。

处理24h, 鳃GSH-Px活性按盐度30、12、24、6、对照组的顺序依次显著降低(P<0.05);48h, 各组GSH-Px活性和24 h的大致类似，但盐度24组显著高于盐度12组 (P<0.05);72h, 盐度12组显著高于对照组和盐度24组(P<0.05),盐度6和30组显著高于盐度24组(P<0.05);96h, 盐度12组显著高于最高盐度30组、对照组和最低盐度6组(P<0.05),盐度24组显著高于对照组和盐度30组(P<0.05),盐度6组显著高于对照组 (P<0.05)。

处理24h, 消化腺GSH-Px活性最高盐度30组显著高于最低盐度6、对照和24组(P<0.05),盐度12和24组显著高于对照组和盐度6组 (P<0.05);48h, 盐度6、12、24组显著高于对照组 (P<0.05);72h, 最低盐度6、12和30组显著高于对照组和盐度24组 (P<0.05);96h, 盐度12组显著高于对照组、盐度24和30组(P<0.05),最低盐度6组显著高于对照组和盐度24组(P<0.05),最高盐度30组显著高于对照组 (P<0.05) 。

Na+/ K+-ATP酶活性

在盐度6、12、24、30胁迫下，彩虹明樱蛤鳃和消化腺Na+/ K+-ATP活性均随暴露时间的延长呈现先缓慢升高后下降的趋势；随暴露时间延长，对照组鳃Na+/ K+-ATP活性无显著变化、消化腺先增加后下降 。

处理24 h, 鳃Na+/ K+-ATP活性盐度12组显著高于盐度24和30组(P<0.05);48h, 最低盐度6组显著高于盐度12、24、30组和对照组(P<0.05);72h, 盐度12和24组显著高于对照组 (P<0.05);96h, 盐度12组显著高于盐度6组、对照组和盐度30组，盐度24组显著高于盐度6和30组(P<0.05),对照组显著高于盐度6组 ( P<0.05)。

处理24h, 消化腺Na+/ K+-ATP活性盐度12、24和对照组显著高于盐度6组 (P<0.05) ;48h, 最低盐度6和24 组Na+/ K+-ATP活性

显著高于盐度12、30组和对照组(P<0.05),盐度12和30组显著高于对照组 (P<0.05);72h, 最高盐度30组显著高于对照组 (P<0.05);96h, 最低盐度6组显著高于盐度12、对照和30组(P<0.05),盐度24组显著高于对照组和盐度30组(P<0.05),盐度12组显著高于盐度30组 ( P<0.05)。

讨论

盐度对彩虹明樱蛤存活的影响

盐度是影响贝类生长的重要因子。如果受到盐度胁迫，贝类需要通过消耗大量的能量来维持自身渗透压平衡，盐度可直接影响贝类的生理代谢进而影响贝类的存活和生长，而不同贝类品种对盐度的适应范围不同。彩虹明樱蛤作为广盐性贝类，此前有文献定性报道其生存盐度范围为6.49～32.74,适宜盐度范围为6.49～26.2;当盐度低于3.87、高于39.9 时，胁迫超过3 d的彩虹明樱蛤会全部发生死亡。

本研究显示，彩虹明樱蛤适宜生存盐度为6～30,与上述研究结果相似，与青蛤 (Cyclina sinensis) (适宜盐度10～35)和文蛤(适宜盐度9.0 ～31.0)等滩涂贝类的盐度耐受范围接近。本研究还发现，彩虹明樱蛤在盐度8～18水体中，外壳呈粉红色，刺激其水管和斧足时反应灵敏；而在盐度5的低盐水体和盐度为50的高盐水体中，蛤外壳色泽发白，水管和斧足受到外界刺激时反应迟钝，推测彩虹明樱蛤生活在盐度过高或过低的水体时，自身生理调节能力减弱，甚至发生死亡。

盐度对彩虹明樱蛤抗氧化酶活性的影响

盐度是海洋环境的重要因子之一，盐度剧变会造成水生动物体内的渗透压改变，刺激机体产生氧化应激反应，诱发生成过量的活性氧自由基 (ROS),引起一系列的氧化损伤 (如DNA损伤、酶失活、脂质过氧化等)。SOD和CAT是清除活性氧自由基的重要酶蛋白，SOD作为清除活性氧的第一道防线，可使超氧阴离子自由基 (O2-) 转化为过氧化氢 (H2O2) 和O2,随后CAT再将H2O2催化分解为H2O和O2,从而达到为机体解毒的目的。

GSH-Px在消除细胞中H2O2方面具有与CAT相似的功能，可以谷胱甘肽 (GSH) 为特异性底物降解H2O2和有机过氧化物。通常情况下，酶活性升高预示着机体中产生了大量的自由基有待清除。随着盐度胁迫时间的增加，菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum)、紫石房蛤 (Saxidomus purpurata) 、大竹蛏 (Solen grandis)、泥蚶的鳃、消化腺、外套膜等组织抗氧化酶活性发生不同变化，但最后均逐渐恢复或基本恢复。

本研究显示，在达到酶活性峰值方面，鳃的SOD和CAT活性均在24h被激活达到峰值，而消化腺则在48h才被激活达到峰值，鳃和消化腺的GSH-Px活性均在48h达到峰值，这是由于SOD和CAT迅速升高到足以清除体内过量的活性氧自由基水平，维持机体正常运转，故在24h时并不需要GSH-Px维持较高水平，但随着时间的延长，体内的氧化产物逐渐积累，GSH-Px水平开始升高，随后又基本恢复至对照组水平。

此外，不同贝类在受到盐度胁迫后其抗氧化酶活性恢复的时间也不一样，如紫石房蛤的SOD和CAT活性在24 h恢复到对照组水平,而近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)、菲律宾蛤仔和青蛤的恢复时间更长，SOD、CAT和GSH-Px活性均在48～96 h内恢复正常，这可能与物种自身的耐盐能力、盐度梯度设置及实验暴露时间等因素相关。如大竹蛏稚贝在盐度34和40胁迫下，其SOD和CAT活性在48～96h恢复至对照组水平，而盐度16组SOD活性则显著高于对照组，稳定在较高水平。故彩虹明樱蛤3种抗氧化酶随时间的延长形成了“Λ”“W”“V”“N”或“И”5种不同的变化趋势。

盐度对彩虹明樱蛤Na+/ K+-ATP酶活性的影响

ATP 酶是一类膜结合蛋白酶，Na+/ K+-ATP酶是钠离子 (Na+)-钾离子 (K+) 泵的重要组成部分，参与细胞内外Na+、K+的主动跨膜转运、维持细胞内外正常的离子梯度，可作为双壳贝类耐盐性能的指示指标。贝类的鳃是其发生生理调节作用的重要场所，包括渗透压调节、呼吸、排泄等，在机体离子调节方面更是起到核心作用。本研究表明，除48h时盐度12、24、30组和96h时盐度6组彩虹明樱蛤鳃的Na+/ K+-ATP酶活性低于消化腺外，在其他盐度的相同暴露时间条件下均是鳃高于消化腺。在同一盐度胁迫下，彩虹明樱蛤鳃和消化腺的Na+/ K+-ATP酶活性变化趋势不同，与白奕天等以文蛤为研究对象的结果相似。LIN等也发现，黑青斑河鲀 (Tetraodon nigroviridis)在相同盐度胁迫下，鳃和肾脏的Na+/ K+-ATP酶活性变化趋势截然相反，表明Na+ /K+ -ATP酶具有组织特异性。

本研究发现，在不同盐度下，彩虹明樱蛤鳃和消化腺的Na+/ K+-ATP酶活性呈先上升后下降的趋势，其体内的Na+/ K+-ATP 酶活性因暴露时间不同变化趋势也有所不同。在水生生物中，已有很多相同或不同的研究结果。例如，盐度骤降下，魁蚶 (Scapharca broughtonii)体内的Na+/ K+-ATP酶活性随着处理时间的延长总体呈先上升后逐渐下降趋势,本研究结果与其相同。凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei)的Na+/ K+-ATP酶活性3d内随处理时间的延长逐渐升高，至3～15d时酶活性趋于稳定；而美洲真蟹 (Callinectes sapidus)Na+/ K+-ATP 酶活性则至8～12d趋于稳定。

在本研究中，还发现彩虹明樱蛤在96h时鳃盐度6与12组和消化腺盐度6、24组的Na+/ K+-ATP酶与对照组存在显著差异，在48h和72h时鳃和消化腺的Na+/ K+-ATP酶活性随盐度的升高呈现较为明显的“U”型变化，在盐度18下则一直较低，这说明彩虹明樱蛤体内Na+/ K+-ATP酶活性恢复稳定可能需要更长时间，原因有待进一步研究。同时，也验证了彩虹明樱蛤的等渗点可能在盐度18附近，而在盐度30或盐度6胁迫下，其需要通过耗能泵出Na+并吸收K+,形成细胞内外的电位势，以启动二级膜蛋白运输及离子通道来维持体内渗透压的稳定。

综上，本研究中彩虹明樱蛤的可生存盐度范围为6～30,最适宜生存盐度范围为8～18。在养殖过程中，盐度过高或过低将会造成彩虹明樱蛤自身抗氧化防御机能损伤和渗透压调节能力降低，最终发生死亡现象。所以，建议彩虹明樱蛤在养殖和保育时，盐度应尽量控制在8 ～18范围内，减少盐度胁迫对养殖成功率的影响。

《文始稚贝盐度适应性的研究》