本文来源：中华结核和呼吸杂志，2023，46（08）：813-818.
本文作者：陈彦欣 徐燕萍 朱迎钢 瞿介明
肺炎克雷伯菌是一种革兰阴性菌，属肠杆菌科（ Enterobacteriaceae family）、克雷伯菌属（ Klebsiella species），主要存在于人类肠道、呼吸道及泌尿生殖道中，可与宿主共生，也可作为机会性病原体或病原体引发感染。根据中国疾控中心发布的2009—2021年间全国急性呼吸道感染患者的病原学检测结果，肺炎克雷伯菌是我国常见的呼吸道革兰阴性致病菌之一。肺炎克雷伯菌引发的感染多为机会性感染的医疗相关感染，死亡率较高，为临床诊治带来了较大困难，因此，对肺炎克雷伯菌防治措施的研究成为了临床上关注的重点。目前针对肺炎克雷伯菌的经验性治疗仍常用β-内酰胺类、氨基糖苷类及喹诺酮类抗生素，然而由于抗生素滥用带来的选择压力，近些年来肺炎克雷伯菌的耐药问题日益严重。根据中国细菌耐药监测网（CHINET）公布的2005—2022年的监测数据，肺炎克雷伯菌的耐药性逐年上升，耐药谱逐渐变广，这一现象大大限制了抗生素的使用。
为了应对临床上愈发严重的耐药现象，多黏菌素作为一类对目前大多数多重耐药菌株敏感的抗生素，在临床上得到了广泛的应用。它是一种由多黏芽孢杆菌产生的环肽类阳离子抗生素，包括A、B、C、D、E五种类型，目前临床上仅使用多黏菌素B和多黏菌素E进行抗菌治疗。多黏菌素可与革兰阴性菌外膜脂多糖（LPS）中脂质A的磷酸基团结合，将自身疏水部分插入细胞膜，改变其通透性，随后通过自发摄取机制透过外膜并将其破坏，导致细胞渗透失衡，达到杀菌目的。多黏菌素的杀菌机制还包括：（1）使内外膜的磷脂小叶产生接触并发生磷脂交换，导致细胞渗透失衡；（2）诱导细菌产生羟基自由基，导致Fe3+流失和铁硫依赖蛋白失活；（3）抑制细菌内膜上的二型NADH脱氢酶（NDH2）活性，扰乱细菌新陈代谢；（4）以剂量依赖的方式与LPS分子结合，抑制脂质A的内毒素活性。
然而，多黏菌素的使用可能会对肺炎克雷伯菌产生诱导作用，使其产生多黏菌素耐药性。多黏菌素类药物的耐药性最早主要由染色体介导进行垂直转移，而随着质粒介导多黏菌素耐药基因（mobile colistin resistance， mcr ）在多国被检出后，多黏菌素耐药性的水平转移也成为关注的焦点，鉴于质粒介导耐药性水平转移的广泛性，加强对多黏菌素类药物耐药性的防范已刻不容缓。
一、耐多黏菌素肺炎克雷伯菌流行情况
过去十年间，全球碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）的多黏菌素耐药率从不超过2%增至9%。美国、加拿大、南美和欧洲均报道了多次耐多黏菌素肺炎克雷伯菌的暴发流行。2013年来，欧洲的碳青霉烯类耐药菌株对多黏菌素的耐药率已上升至33%以上，意大利的CRKP多黏菌素耐药性高达43%，希腊为20.8%，西班牙为31%。根据2017年我国的一项多中心研究显示，我国临床分离到的耐多黏菌素肺炎克雷伯菌少而散发，检出率约为0.7%。 图1 为CHINET统计的2017年至2022年全国1 000余所医院中采集到的克雷伯菌属对多黏菌素的耐药情况。目前数据显示，我国的耐多黏菌素克雷伯菌检出数逐年增高，但总体的耐药率仍较低，多黏菌素依然是目前治疗多耐药肺炎克雷伯菌感染的强有力手段。
▲ 图1 2017年至2022年间CHINET统计的网站成员单位所收集的克雷伯菌属对多黏菌素的耐药情况
二、肺炎克雷伯菌中常见的耐多黏菌素机制
（一）作用靶点结构的改变
多黏菌素作用靶点为细菌外膜LPS的脂质A，其耐药机制多与脂质A的结构改变有关，例如在脂质A中插入带正电荷的结构（如磷酸乙醇胺，pEtN和L-4-阿拉伯糖，L-Ara4N等）可减少与多黏菌素的静电相互作用，从而降低细菌对多黏菌素的敏感性。介导这一过程的基因可位于染色体上，也可位于质粒等可移动遗传元件上。
1. 双组分调控系统（two-component regulation system）：双组分调控系统是细菌中一种重要的信号传递系统及基因表达调节系统，可介导细菌在阳离子抗菌肽环境中产生适应性。与多黏菌素耐药性相关的双组分调控系统包括 pmrAB 系统、 phoPQ 系统和 ccrAB 系统，它们之间还存在相互调控关系，共同介导耐药性的表达。
如 图2 所示， pmrAB 系统和 phoPQ 系统被环境中的多黏菌素激活，具有组氨酸激酶活性的组分PmrB和PhoQ便催化效应调节蛋白PmrA和PhoP发生磷酸化，磷酸化的PhoP可上调 pmrD 基因的表达，进一步促进并使PmrA稳定于磷酸化状态，进而激活编码pEtN磷酸转移酶的 pmrCAB 操纵子、参与脂多糖修饰过程的 pmrE 基因以及参与L-Ara4N合成的 pmrHFIJKLM 操纵子，从而将pEtN或L-Ara4N插入脂质A 。同时，磷酸化的PhoP也可直接激活 pmrHFIJKLM 。
▲ 图2 常见的耐多黏菌素肺炎克雷伯菌中细胞膜脂多糖修饰基因及其作用机制
crrAB 系统主要通过调控下游的 crrC 基因（又名H 239_3062 基因）来影响细菌的多黏菌素耐药性。其组分 crrB 基因发生突变时会上调 crrC 的转录，进而导致 pmrAB 系统过表达以及 pmrHFIJKLM 操纵子、 pmrC 和 pmrE 基因的激活。此外， crrC 还会与周围基因共转录，其中便包括编码RND型外排泵的H 239_3064 基因，该基因转录上调会导致菌株对多黏菌素、四环素及替加环素的耐药性增加。因而相比于其他耐药机制， crrB 的突变可导致肺炎克雷伯菌产生更强的耐药性。
2. mgrB 基因： mgrB 基因可通过抑制PhoQ的表达及抑制PhoP的磷酸化对 phoPQ 系统进行负反馈调节，因此该基因的失活可导致 phoPQ 系统表达上调，使菌株产生多黏菌素耐药性。 mgrB 常见的失活机制包括插入序列介导的基因重组以及基因突变导致的氨基酸序列改变或翻译过程提早终止，由于在临床上此类突变的检出率较高，因而一般认为 mgrB 基因突变是导致多黏菌素耐药性产生的重要机制。
3. mcr 基因：该基因编码的pEtN转移酶可介导pEtN结构插入脂质A，降低细胞膜与多黏菌素的结合亲和力。目前在自然界中已有多种重要的 mcr 等位基因检出，肺炎克雷伯菌中常见亚型为 mcr -1、 mcr -7和 mcr -8。 表1 列出了较为重要的 mcr -1至 mcr -10等位基因最早被分离并报道的年份与地点。
mcr -1的转移通常由插入序列IS Apl1 介导，当基因两端存在该插入序列时， mcr -1会与之形成复合转座子，通过“复制粘贴（copy-out，paste-in）”机制进行转移，如转座子Tn 6330 （IS Apl1 - mcr -1-orfIS Apl1 ）从质粒上被切下后形成的IS Apl1 - mcr -1-orf中间产物可整合到其他携带IS Apl1 的质粒中，造成耐药性的播散。插入序列IS 1 也可出现在 mcr -1上游，协助其转座
相比 mcr-1 ， mcr-7 与 mcr-8 的检出率较低。研究发现，目前检出的此两种基因常与bla NDM 等碳青霉烯酶基因共存于同一菌株中，如2022年中国报道了一株同时携带 mcr-8 、bla NDM 及 tmexCD1-toprJ1 基因的肺炎克雷伯菌，通常情况下这三种抗性基因均位于不同类型的质粒上，但在环境中多黏菌素的选择压力作用下，这三种抗性基因所在的质粒可在插入序列IS 26 和 ltrA 的介导下发生偶联，并且，多黏菌素的存在还提高了杂交质粒的稳定性。这一现象说明多黏菌素的使用可能会加速多耐药菌株的形成，为今后的临床诊治敲响了警钟。
（二）屏障系统改变——荚膜多糖（CPS）的生成增多
研究表明，CPS携带的负电荷可与多黏菌素携带的正电荷结合，从而阻止多黏菌素与脂多糖的结合，提高细菌的耐药性，这种保护作用与CPS的血清型或化学成分均无关，而是仅取决于菌株产生的CPS量。因而当CPS生成增多（如多黏菌素和乳铁蛋白可诱导CPS操纵子的表达上调）时，肺炎克雷伯菌对多黏菌素的耐药性便会增加。
（三）RamA基因与AcrAB、OqxAB外排泵的活化
RamA 基因可在革兰阴性杆菌中调控多种药物耐药性的表达。该基因可与编码耗能型外排泵的 acrAB 基因和 oqxAB 基因的启动子结合，介导其表达上调，从而将多黏菌素从细胞质中排出，降低多黏菌素对细菌的*伤杀**作用。
三、异质性耐药
异质性耐药是指同一分离株的不同亚群对抗菌药物表现出不同敏感性的现象，出现耐药性的亚群可逃逸抗菌药物的*伤杀**继续繁殖，若异质性耐药株在抗菌药物压力下持续被选择，便会使该分离株对此类抗生素的抗性不断增加。异质性耐药菌无法通过常规药敏试验发现，常被临床忽略，存在隐形危害。
肺炎克雷伯菌多黏菌素异质性耐药的产生多与 phoPQ 双组分系统的表达上调相关，当 pmrAB 及 phoPQ 系统组分发生突变或 phoP 、 phoQ 、 pmrD 编码的mRNA显著过表达时，肺炎克雷伯菌亚群便会获得多黏菌素耐药性，出现异质性耐药。另外，日本学者于2020年报道了一株 mutS 基因突变介导产生多黏菌素异质耐药性的肺炎克雷伯菌SMKP03。该菌株上编码DNA错配修复酶的 mutS 活性区域被无义突变截断，使菌株自发性产生多黏菌素耐药性的概率大大提高，从而更易产生多黏菌素异质耐药性。同时，介导LPS表达的 lpxM 基因与 yciM 基因缺失突变在表达异质性耐药的菌株中也有报道，说明LPS的表达上调也可导致多黏菌素异质性耐药现象的产生。
四、耐多黏菌素肺炎克雷伯菌的快速检出
目前多黏菌素的药敏检测方法和结果判定仍存在诸多争议。2016年欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）和美国临床实验室标准协会（CLSI）的多黏菌素折点联合工作小组共同推荐使用ISO-20776标准微量肉汤稀释法作为测定肠杆菌、铜绿假单胞菌和不动杆菌属对多黏菌素类药物体外敏感性的参考方法，2020年针对肠杆菌和铜绿假单胞菌又新增了多黏菌素E肉汤纸片洗脱法和多黏菌素E琼脂实验。但以上检测方法均用时较长、准确性低，难以广泛在常规医疗机构中开展，且目前临床上暂无统一的多黏菌素药物敏感性试验折点标准，为临床诊治带来了较大困难。为了快速评估细菌对多黏菌素的敏感性，国内外的学者在现有的检验技术上不断发展，探索出了一些更为高效的药敏早期评估方法。
1. 快速多黏菌素NP试验：该试验利用细菌生长时会进行糖酵解的特点，在已知浓度的多黏菌素中通过监测体系pH值的变化来测定葡萄糖发酵后产生的酸性代谢物浓度，反映细菌的生长状况，侧面评估细菌对多黏菌素的抗性。该试验方法简单，可在2 h内得出结果，其敏感度为99.3%，特异度为95.4%。
2. 环介导等温扩增技术（LAMP）：该技术可用于对 mcr-1 基因的特异性检测。相比于常规聚合酶链式反应（PCR）技术，LAMP的成本更低、效率较高。该技术利用 mcr-1 基因的特异性引物与样本DNA混合进行扩增反应，检测限度0.2 pg/μl，还可以用于检测粪便样本中的 mcr-1 基因。
3. 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）：该技术目前已广泛应用于微生物的检测鉴定中，但对于微生物耐药性的检测仍具有一定的局限性。有学者提出可以利用革兰阴性菌的脂质A、革兰阳性菌的心磷脂和脂磷脂酸等微生物特异的脂质作为样本，不仅利于更高效地检测微生物的种类，且可用于多黏菌素抗性的检测。随后的学者对这一方法进行改进，优化了脂质提取的方法，改进后该试验操作简单，可在1 h内完成对微生物种类及其对多黏菌素耐药性的检测，具有在临床上广泛应用的潜力。
五、耐多黏菌素肺炎克雷伯菌的治疗策略
目前的研究证实，多黏菌素是CRKP菌株产生多黏菌素耐药性的唯一独立危险因素。因此，探索合理应用多黏菌素的方法及寻找多黏菌素替代药物成为了目前研究的热点。
（一）与其他药物的联合治疗
研究发现，多黏菌素与其他抗生素联用后的杀菌效果较多黏菌素单药应用时增强，这可能是因为黏菌素改变细菌外膜的通透性后，可使其余抗生素更容易进入细菌内部，因此，多黏菌素也可以增强原本耐药的细菌对抗生素的敏感性，改善耐药情况。目前常见的治疗方案包括与磷霉素、碳青霉烯类药物、氨基糖苷类药物和替加环素类药物的联合，并辅以头孢他啶/阿维巴坦等β-内酰胺酶*制剂抑**的使用，也可与阿米卡星、阿奇霉素、利奈唑胺等革兰阳性菌相关抗生素联用。与其机制类似的药物还包括乙二胺四乙酸（EDTA）、MAC13772和槲皮素，EDTA可以增强细胞外膜的通透性，使多黏菌素更易进入细胞，还可与细胞内必要的呼吸酶进行螯合，增强细菌对多黏菌素的敏感性；MAC13772是一种生物素合成*制剂抑**，同时具有抑制脂肪酸合成的作用，它可作用于细胞膜的磷脂双分子层，降低膜的流动性，影响内外膜的磷脂交换，诱导细菌裂解，并恢复其对多黏菌素的敏感性；槲皮素可直接破坏细菌细胞膜的完整性，在抑制细菌生长的同时降低其耐药性。
（二）新型药物的研发
1.苯唑霉素：苯唑霉素是一种新型的半合成氨基糖苷类药物，可通过与细菌核糖体30S亚基结合来抑制蛋白质合成。相比于常见的氨基糖苷类药物，苯唑霉素具有独特的分子结构，因而不易被现有的氨基糖苷类水解酶分解，从而保证了对耐药菌的敏感性；并且其肾毒性及耳毒性较现有药物更轻，具有较高的安全性。
2.头孢地洛：头孢地洛是一种新型的“铁载体”头孢菌素，可在细胞外结合游离铁离子，随后通过细菌本身的铁转运系统通过细菌膜运输，进入细菌细胞后头孢地洛与青霉素结合蛋白结合，便可抑制细菌细胞壁的合成，是针对多黏菌素耐药性肺炎克雷伯菌的最有前景的抗生素之一。
3.K11抗菌肽：K11是一种由三种天然抗菌肽合成的合成抗菌肽，其携带的正电荷与细菌细胞膜结合可破坏膜电位，改变细胞膜通透性，使细菌内容物渗出，最终导致细菌死亡。它具有抗菌谱广、结构稳定、细胞毒性弱的优点，杀菌作用强，且不易产生耐药性，同时对细菌荚膜的生成具有很强的抑制作用，因而具有较大的临床应用前景。
（三）噬菌体的应用
噬菌体是一种侵袭细菌的病毒，存在着菌株特异性，且可与靶标菌株共同进化，相比于抗生素，噬菌体出现耐药性的概率更小，且对体内益生菌的影响更小，因此，噬菌体可作为抗生素的替代物用于耐药菌的治疗中。同时研究发现，对噬菌体产生抗性的细菌反而会导致抗生素对其敏感性增加，其机制可能为在细菌对噬菌体产生耐药性的过程中可能会丢失部分耐药基因，导致细菌失去对抗生素的耐药性，其机制仍待进一步的探索。
六、结论
近年来，由于多黏菌素的过度使用，肺炎克雷伯菌对其耐药的现象屡见报端。常见的多黏菌素耐药机制多与其作用靶点——细胞膜脂多糖的结构改变相关，菌体外荚膜的增厚及菌体上外排泵的表达上调也可导致肺炎克雷伯菌对多黏菌素耐药。目前发现的多黏菌素抗性基因多位于染色体上，但已经出现了位于质粒上的 mcr 家族基因，可在菌株间水平转移，传播多黏菌素耐药性。因此，为预防多黏菌素抗性基因的扩散，对其水平转移机制的进一步探索是十分必要的。另外，肺炎克雷伯菌对多黏菌素存在异质性耐药现象，其机制与常见耐药机制类似，多涉及双组分系统或其他参与脂多糖结构形成的基因突变。异质性耐药菌无法通过常规药敏试验发现，因而临床急需一种更高效的检测方法，同时未来也应着手探究异质性耐药现象的诱发因素，从而对临床用药进行针对性的指导。当前多黏菌素的药敏检测方法和结果判定仍存在着诸多争议，研究者们已经开发出许多快速检测的方法，不过，这些方法仍需要投入临床使用来进行效果的检验。最后，研究发现多黏菌素与其他抗生素联用可减轻耐药菌株对其的耐药性，为合理用药提供了有力证据。由于多黏菌素强大的抗菌作用，目前暂时无法将其淘汰，但研发敏感性强、毒副作用小的新型抗菌药物，将成为未来重要的研究方向之一。
本文编辑：吕小东