近年来，造成人类感染性疾病的病原微生物日益复杂、种类增多，抗菌药物滥用致使细菌耐药，病原微生物已成为全球关注的焦点。感染是急危重症患者死亡的主要原因之一，随着新发病原微生物的出现、耐药病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染性疾病的发病率和死亡率居高不下。据WHO统计，在全球，感染性疾病导致的患者死亡占全部死因的25%以上，每年约1300万儿童死于感染性疾病。在中国，感染性疾病占所有疾病的50%以上，75%造血系统肿瘤患者和50%实体肿瘤患者死于感染，脓毒症（严重感染）患者病死率高达50%。重症感染起病急、进展快、病原体复杂，对于重症感染患者，能否快速确认感染病原体，是后续对症治疗的关键，宏基因组新一代测序技术（metagenomics next-generation sequencing,mNGS）为解决这一问题提供了一个可能的突破方向。
宏基因组测序的技术优势
传统的微生物鉴定方法分为培养和非培养两类。临床公认的“金标准”是分离培养和生化鉴定，这种方法的操作周期长、失败率高，并且不是每种病原体都可以培养。不依赖培养的方法，比如涂片镜检、抗体抗原免疫等，在采样当天即可报告结果，这些方法的时效性强，但在敏感性和特异性上存在较明显的劣势，而且传统的微生物鉴定方法无法快速识别未知或者罕见的病原微生物。mNGS不依赖于传统的微生物培养，也无需特异性扩增，可直接对临床样本中的核酸无差别、无选择性地进行高通量测序，与已知微生物序列数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫）。
在急危重症感染中，患者往往因为遗传性疾病、肿瘤、营养不良、器官移植、药物等因素导致免疫缺陷，除了受到普通感染外，还尤其容易受到机会性感染，即条件致病菌引起的感染。这类感染涉及的微生物种类复杂，很难根据经验提前预判，常规检测方法无法覆盖。相比之下，mNGS理论上可以报告所有已知基因组序列的病原体，目前被纳入的病原体已有8000多种，其中包括3000余种细菌、4000余种病毒、200余种真菌和140种寄生虫，除了病原体覆盖广、准确性高，mNGS还可以获取耐药突变信息和毒力基因，高覆盖度的mNGS还可以评估病原体的药物敏感性，精准指导临床用药。
凭借上述优点，mNGS逐渐开始被一些临床医生认可和尝试使用，相关的临床指南和专家共识也对mNGS有所提及。《中国利什曼原虫感染诊断和治疗专家共识》提到：“有文献报告用二代测序等方法成功诊断骨髓穿刺与活组织检查未能发现的病例，将来有可能应用于临床。”《儿童呼吸道感染微生物检验标本采集 转运与检测建议（细菌篇）》指出：“全基因组测序是对感染性疾病病原体的大规模核酸分析，可提供极为丰富的信息，对于未知病原体的发现具有不可比拟的优势，是分子生物学诊断的研究热点。”《儿童呼吸道感染微生物检验标本采集 转运与检测建议（病毒篇）》提到：“二代测序技术不但在高通量方面表现出优势，而且在发现新病原方面也有突破性进展，但目前二代测序的结果还需要验证，不能直接用于临床诊断，且费用较高，要广泛应用尚待时日。”《终末期肝病合并感染诊治专家共识》提到：“二代测序方法从组织、拭子、抽吸物中提取DNA进行分析，可筛查鉴别多种细菌，快速获取病原学诊断。”《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南（2018版）》指出：“基于测序技术的临床宏基因组学，通过分析临床标本中微生物的DNA或RNA含量与丰度判断致病菌，显著提高了病原检测的敏感度，缩短了检测时间，对罕见病原菌感染的诊断具有优势，可审慎地用于现有成熟检测技术不能确定的病原体，或经恰当与规范抗感染治疗无效的患者，但检测结果需结合流行病学和临床特征综合评估是否为致病菌。但该技术应用于临床尚需解决许多问题，包括标本中人类基因组的干扰、生物信息学分析、结果判断和解释等，特别是呼吸道本身为非无菌状态，大量定植菌核酸的存在给临床结果的判读带来了挑战。”2019年，《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》发布。
由已发布的临床指南和专家共识可以看出，虽然临床指南和专家共识开始对mNGS有所提及和推荐，但仍然持比较谨慎的态度，对其目前的结果验证、检测成本和开展条件等方面都给出了尚不成熟的提示。mNGS是基于二代测序成本快速降低而兴起的一个全新领域，若用于体外诊断试剂的研发，有其优势，但也存在很多技术和监管难点。
临床应用的技术难点
需建立标准化操作程序
mNGS需要对不同类型的临床样本进行预处理，操作步骤包括但不限于核酸提取、文库制备、纯化、定量、上机前质控等，还需进行测序反应和数据分析，整体流程复杂、耗时长、自动化程度低。大多数文库制备方法包含PCR扩增步骤，有可能产生气溶胶污染，样本在实际临床取样、运输、处理、上机测序等环节中都有可能受到环境、容器、试剂中的微生物核酸污染。因此，实验室在防止污染和质量控制方面需要建立一系列标准化操作程序。
高灵敏度是把双刃剑
mNGS可以覆盖8000种以上病原体，检测灵敏度很高，这是一把双刃剑。环境、容器、试剂中的微生物核酸污染以及人体含有的定植微生物（不同个体、不同样本类型，定植微生物的种类和丰度有很大差异），都会导致mNGS的结果中含有大量非致病性微生物，而真实的病原体则隐藏在定植和背景微生物中。因此，如何结合样本类型、实验对照和临床信息来准确判断病原体，是必须攻克的难题。对于mNGS的检测报告，检测机构应尽可能提供检测列表，由临床医生结合检测结果和临床病史做出判断。
胞内菌/厚壁菌检出率低
胞内感染菌释放到体液中的含量较少，导致其检测敏感性偏低；具有较厚细胞壁的病原微生物（如真菌）的核酸提取效率较低，导致其临床检出率和敏感性较低。因此，即使检测报告显示某种胞内菌/厚壁菌的检出序列数不高，也要考虑其为致病病原体的可能。mNGS信息量大，很难在检测报告中列举出所有检测到的病原体，对于罕见病原体、胞内菌等，可能因检出序列数少、微生物丰度低，在检测报告中未被列举，如果临床有疑似特殊病原体的感染，可以追溯原始数据进行查询。
RNA检测难度大
一些病毒的基因组为RNA，用DNA建库的方法不能检出。同时，RNA丰度与基因转录活跃程度正相关，检测RNA可以识别死菌和活菌，区分现行和既往感染。因此，与只进行DNA测序相比，同时对DNA和RNA进行测序的方法具有多重优势，但相比于DNA，人源RNA的丰度和复杂度较高，且易降解，对样本运输和保存有更高的要求。如何稳定有效地实现DNA和RNA同时检测，是提升mNGS临床检出率和准确性的保障之一。
平衡灵敏度和经济成本是难题
最终的测序数据由微生物序列和人源基因组序列组成，人体不同类型样本单位体积含有的细胞数量有巨大差异，人体细胞数的不同、病原微生物感染的类型不同和病原微生物感染量的高低都会影响测序数据中目标微生物序列占比，人体背景细胞多（如全血样本）以及很多病原体感染后含量很低（包括用药后取样导致的病原数量降低）等因素，都会导致限定数据量中的靶病原由于信息太少而丢失。扩大数据量、提高检测深度是解决这一问题最简单的办法，但同时会带来检测成本的大幅度上升，如何平衡临床灵敏度的需求和检测成本的迅速增加，可能是mNGS面临的最大挑战。
尚不能完全指导耐药菌用药
目前，使用mNGS进行耐药检测还存在一定困难，原因有以下两点：一是目前报道的耐药基因型与耐药表型的关联程度还存在一定差距；二是应用mNGS对临床样本进行耐药相关基因的分析需要极高的测序深度，成本将增加数千倍。因此，当前的mNGS尚不能完全指导耐药菌抗感染药物的选择。
明确应用的场景是关键
目前，微生物检验室对于微生物的鉴定有一套成熟的检验流程，mNGS作为一种全新的检测手段，如何在当前微生物检验流程中找到适合的切入点？如何科学地设计产品、合理地选择预期人群并在正确的时机开展检测？作为一种实验室新兴技术，找到适合的应用场景是mNGS向产业化转变的关键。
监管及审评重点
mNGS作为一项优势明显的技术，向产业化转变是必然趋势，在相关医疗器械监管过程中，尤其是体外诊断试剂审评过程中，以下方面应该重点考虑。
1. 规范临床适用人群及临床适应证。根据目前的临床经验、研究结果和mNGS技术的优势，mNGS的临床适用人群应以急危重症感染患者为主，其主要适应证包括：①病情危重需要尽快明确病原体；②特殊病人，如免疫抑制宿主、合并基础疾病、反复住院的重症感染患者，需要尽快明确病原体；③传统微生物检测结果反复阴性且治疗效果不佳；④疑似新发病原体、临床上提示可能有一定的传染性；⑤疑似特殊病原体感染；⑥长期发热和/或伴有其他临床症状、病因不明的感染。
2. 应结合患者负担和收益比，重点对产品的临床意义进行审评。
3. mNGS可以早期发现病原体，指导抗菌药物的精准选择，减少抗菌药物的使用，降低患者病死率，但尚需要大样本的研究证实，因此，mNGS在临床试验阶段应根据其产品设计，选择预期用途的适用人群进行足够样本量的验证。同时，由于mNGS产品临床可能的适用人群的特殊性和罕见性，入组足够数量的人群可能会存在较大困难，这一点可能会是临床试验审评中的难点。
4. 对于感染严重、生命体征不稳定的患者，由mNGS获得致病病原体后，针对病原体进行精准治疗，治疗后应密切随访患者的临床表现和治疗效果，应有随访数据。
5. 病原特征数据库与算法要有系统研发，对算法的审评应结合数据库一起作为审评的重点环节，不能简单认为把公共数据库中的微生物数据纳入越多越好。
目前，由于mNGS的转化仍存在一定难度，我国尚无体外诊断类产品申报。
（文：胡鹏 作者单位：国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心临床与生物统计二部）
