文 |爱叨叨的小胖

编辑 | 爱叨叨的小胖

背景

许多研究发现，不同奶牛群体的产奶性状的数量性状位点，存在分离性。

然而，即使对于饱和标记图谱的相对较大的效应，通过连锁分析的QTL定位的置信区间跨越数十个图谱单位，或数百个基因。

许多研究表明，通过应用连锁不平衡映射， 可以使QTL的CI进一步降低 ，这需要在CI内对额外的多态性进行基因分型通常是单核苷酸多态性。

虽然CI内的任何标记都可以用于LD定位，但从嵌入在QTL候选基因中的多态性开始是合理的。

图1三个微阵列实验的维恩图

在区间内，与该性状有一些生理相关性的基因，将被认为是QTL的主要候选基因。

参与甘油三酯合成的DGAT1基因，是QTL影响BTA14上乳脂的致病基因，结合定位和排列作为一种识别候选基因的方法。

图2，212个显著差异表达的基因

因此，基因表达分析，可以通过揭示复杂性状基因的调控变异，从而弥合精细定位和数量性状核苷酸（QTN）测定之间的差距。

表达序列标签（EST）的特异性组织起源、组织特异性和组织选择性，基因表达也可能表明了基因在QTL调控中的潜在作用，微阵列已被用于测量相对表达，从而 确定负责QTL的候选基因。

图3重要基因按功能类别划分的分布

选择QTL候选基因的其他标准如下：1.基因优先在与数量性状相关的器官中表达，即与产乳性状的乳腺。2.基因优先在与表型相关的发育阶段优先表达，即在产乳性状的哺乳开始阶段。

表1，QTL候选基因

有学者测量了小鼠和牛的蛋白质编码转录组，并使用它们在基因图谱中，描绘了一组牛和小鼠组织，从而为解决组织特异性表达提供了资源。

表2显著基因的基因图谱

美国农业部宣布了一项项目，利用来自100个牛基因组组织的基因表达分析数据 构建牛基因图谱。

cDNA微阵列资源增强牛乳腺开发，和牛寡核苷酸DNA微阵列被用于识别雌激素反应基因在牛乳腺，在小鼠中已经进行了关于乳腺在乳腺、青春期、怀孕、哺乳和退化期间的基因表达的详细研究。

图4，cDNA微阵列表达式轮廓签名的聚类

在这些研究中，相同的微阵列平台被用于类似的小鼠自交系， 导致了高水平的复制 ，从而成为与产乳性状相关的乳腺组织基因表达的最佳数据资源之一。

图5，cgQTL数据库

此外，哺乳动物中基因顺序的高度保守性使得比较定位，成为一种有用的方法，将小鼠和牛的之间具有相似功能的基因簇连接起来。

我们利用小鼠乳腺基因表达，结合牛QTL定位数据创建了一个web工具，该工具汇编了所有可用的信息，以帮助鉴定奶牛产奶性状中的QTL候选基因。

图6，BTA6与候选基因的共定位。

小鼠乳腺组织

我们准备了3只C57雌性小鼠青春期，3只怀孕小鼠、2只哺乳期和2只哺乳后的小鼠，随后将它们放置在RNAlater中，并保持在-80°C， 用Trizol分离RNA ，受孕日期被指定为观察到阴道塞的日期。

表3四个发育阶段（青春期、怀孕、哺乳、退化）的K-means聚类

通过对胚胎发育阶段的评估，确认了第14天的怀孕小鼠胚胎的特征是单个手指在前，足板中分离。

如果一个基因的表达，是基因图谱所有组织的中位数的3到10倍，则其乳腺特异性表达在导航器中用单星表示，两颗星的范围为10到30倍，三颗星为> 30倍表达。

我们将这些小鼠乳腺基因与牛的QTL候选定位划分为 17个不同的类别 。在氧化石墨烯信息不足的情况下，蛋白质的保守结构域、同源基因的GO信息和数据从已发表的文献中，我们被用来将该基因分类为一个功能类别。

结果：从三个实验中获得的基因表达分析

在本研究中，使用方差分析共获得了278个在四个阶段，具有显著差异表达的探针集。另外还有两个微阵列实验，使用相同的统计分析发现了数千个显著的探针集。

在三个单独实验和克拉克森和斯坦的两个实验中发现的探针集观测频率和预期频率。在克拉克森和斯坦因实验中，联合发现探针集的卡方值为2834。在当前研究的278个显著探针组中，249个对所有三个实验都是共同的，期望值仅为77，卡方值为3240。

这249个探针集被分配到212个牛基因上，排除了3个包含重复序列的克隆、21个未知探针集和13个冗余探针。它们大多数基因被划分为 代谢、免疫级联、转运、转录调控和信号转导功能类别。

采用5~15K均值聚类方法，212个基因的表达解释方差从51~62%不等，根据最高解释方差和最小冗余度，确定6个K-means分类为最优聚类数。

聚类解释了53%的表达方差。六个集群中的每一个都有其独特的表达谱特征(青春期，preg-南希期，哺乳期，退化期)。

在本次实验中，我们发现在牛的基因中仅哺乳期就有87个过表达基因，哺乳期有72个过表达基因，其他阶段表达存在差异， 泌乳期的典型基因包括乳蛋白和生物发生基因 。

有15个基因仅在退化时表达上调，如CXCL14和SLPI，它们参与了化学分类和免疫反应过程，有32个基因仅在妊娠期表达上调。例如，参与发育和细胞分化的CRABP2和CSRP1就包括在这一组中。

包括肌凝蛋白在内的6个基因中最小的一组在青春期表达上调，在哺乳期表达下调。在212个显著基因中，有82个表现出乳腺特异性表达。其中，73个基因在哺乳期开始时表达上调，其余基因在妊娠和退化时表达上调。

比较映射

正在进行的对牛基因序列上的基因进行注释的工作，允许鉴定出以MG-U74Av2探针集为代表的小鼠基因的许多牛同源基因。

然而，对于许多基因的染色体位置仍然是未知的，有学者报道了：基于牛基因组预测牛染色体位置的 准确率约为90% 。因此，我们利用牛的同源基因序列来预测染色体位置未知的牛基因的位置。

讨论

用乳腺阵列的三个数据集在青春期、妊娠、哺乳和退化的四个发育阶段进行了比较，在四个选定的发育阶段的乳腺，由不同的细胞群和过程组成。因此，如果在分析中包含足够数量的重复，大多数基因将表现出不同的表达。

二微阵列实验使用了75个动物重复，而目前的研究使用了9个动物重复，对三个实验的数据进行了 相同的滤波、归一化和方差分析。

前两项研究发现了数千个重要的基因，而在目前的研究中发现了数百个，这显然是由于重复次数的主要差异。

在乳腺特异性探针组中，只有4个功能未知（100949_at，160549_at，103343_at，93479_at）。这些基因的分析，可能揭示了它们在乳腺中的重要作用。

通过比较定位，几乎所有的差异表达基因，都被定位到牛的染色体位置。在哺乳动物进化过程中，啮齿动物谱系的染色体断裂率，比牛谱系增加了一倍。

因此，我们基于牛基因组，对牛染色体位置的预测和详细比较图谱，这些基因在四个发育阶段的每个阶段进行表达编码（0、1、2），并在81个可能的谱组合中 聚为6个表达谱 。这些集群对应的基因，在怀孕或哺乳或退化时，显示出独特的上调，以及在涉及青春期、怀孕和哺乳等阶段的组合中出现的差异表达。

我们的cgQTL网络工具允许在牛产奶量QTL的图谱、覆盖的候选基因，和它们在乳腺阵列和基因图谱中的表达的可视化呈现之间进行对比。

这些基因是乳腺特异性的，为了真正推断一个位于QTL中的差异表达基因是一个正在研究的性状的候选基因，我们需要提供关于该基因的顺式或反式调控的信息。

然而，这样的数据是不可用的，而我们开发的cgQTL工具，是为了提供当前最好的信息汇编，以确定牛产奶的候选基因，并随着我们添加更多的信息来源，将继续改进。

本次试验中显示了BTA6上影响产奶性状的候选基因与QTL的共定位,ABCG2被列为8个候选基因之一。在两个已被证实的影响奶牛产奶性状的基因中，ATA6和14上的ABCG2和DGAT1， 只有前一个基因，在泌乳开始时在乳腺中表达上调。

这两个基因都已被证明会影响绵羊的肌肉发育,而猪的肌生成抑制素（GDF8）和IGF2在肌肉中的表达存在差异。因此，影响家畜中QTL的4个基因中，有3个在器官中，都有过表达。

cgQTL可以根据器官的差异表达，来确定QTN分析的候选基因的优先级。然而，MG-U74Av2阵列的探针数量有限，只代表不到小鼠基因组的一半，所以未来的研究阵列将需要更新当前的网络工具，这就可以反对使用小鼠数据，来推断牛乳腺基因表达的可行性了。

然而，我们在这项工作中的目标，是创建一个工具（cgQTL），利用最佳的可用信息来源，如乳腺发育过程中的小鼠，基因表达数据和牛QTL定位数据，以开发潜在的QTL候选基因的假设。

这是一种比较的方法，来整合信息在困难的任务中识别候选基因，我们设想：在未来，cgQTL中使用的小鼠基因表达数据将与使用cDNA微阵列、牛寡核苷酸阵列和“基因芯片”阵列实验的牛基因表达数据相补充。

cgQTL导航器还将与牛基因图谱相连，该基因图谱将使用来自100个牛组织的基因表达分析来开发。同样， cgQTL可以用于繁殖的QTL 。可以将卵巢转录组研究的各种资源整合到cgQTL中，以预测与生殖性状相关的QTL候选基因。

结语

在这里，我们提出了一个QTL（cgQTL）候选基因的网络工具，它允许在牛奶生产QTL图谱、覆盖的候选基因和它们在乳腺阵列和基因图谱中的可视化表达之间导航。

影响家畜中QTL的4个已确认的基因中有3个在靶器官中过表达。

因此，cgQTL可用于确定牛QTL候选基因的优先级基于器官差异表达的分析。