简述rna含量测定的方法及其原理 (rna pull down实验原理与步骤)

一．探针准备

1实验目的： 构建hsa_circRNA_407176全长载体,以hsa_circRNA_407176质粒全长序列为模板PCR扩增获取含有T7 promoter序列的正义链和反义链DNA，后期作为RNA pull down的探针。

2实验材料

l 主要试剂

l 主要仪器及器材

3基因及载体信息

> hsa_circRNA_407176

l GCAGCTTCAAGGTTACTGACTTTTTATGATGTTTGGTGGCTATGAGACTATAGAAGCATACGAAGATGATCTTTATCGAGATGAGTCATCTAGTGAACTGAGTGTTGATAGTGAGGTGGAATTTCAACTCTATAGCCAAATTCATTATGCCCAAGATCTTGATGATGTCATCAGGGAGGAAGAGCATGAAGAAAAGAACTCTGGGAATTCGGAATCTTCGAGTAGTAAACCAAATCAGAAGAAGCTAATCGTCCTTTCAGATAGTGAGGTCATCCAGCTGTCAGATGGGTCAGAGGTCATCACTTTGTCTGATGAAGACAGTATTTATAGATGTAAAGGAAAGAATGTTAGAGTTCAAGCACAAGAAAATGCCCATGGTCTTTCTTCTTCTCTTCAATCTAATGAGCTGGTTGATAAGAAATGCAAGAGTGATATTGAGAAGCCTAAATCTGAAGAGAGATCAGGTGTAATCCGAGAGGTCATGATTATAGAGGTCAGTTCAAGTGAAGAGGAAGAGAGCACCATTTCAGAAGGTGATAATGTGGAAAGCTGGATGCTACTGGGATGTGAAGTAGATGATAAAGATGATGATATCCTTCTCAACCTTGTGGGATGTGAAAACTCTGTTACTGAAGGTTAGTATCATATTGGCCATTTTGAAAGTAGTATCATCTTTCATAAGGAGGACTGCTTTTCCTAGAGAAAAGACCAATAGGGTCTACTCCGTTTAATTCCTCACTTTTTGGTCTTGTTTTTTGGTTTGTTTCTCATGCGACTCTCTTACCAGTGGCTACTCTAATGGTGGTTTGTCTGAACGTCAGAAAGAGTATGTCAGAATACCAAAGACACTCTGCTTCTGCTGTAAGCAGATTCATAGCTGCTTCTTCCTGTTTGGCTAGAGCCAGTTCTGGACCTGAAATCTTACTTCCCCCCTCTCTCTCTGCTTGGTACCA

l 引物序列

表1 PCR的引物序列（红色部分为T7 promoter序列）

4实验方法

l PCR扩增目的片段

表2 PCR反应条件

表3 PCR反应体系

全长基因片段的获取，纯化、回收(DNA回收试剂盒，天根：DP214-02 ) ，以全长片段为模板用sense-F/sense-R和AntiSense-F/AntiSense-R引物PCR扩增获

取正义链和反义链的目的基因，跑2%琼脂糖凝胶电泳检测，90V，30min。

l 胶回收

1、柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500µl平衡液BL，

12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2、将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净EP管中，称取重量。

3、向胶块中加入等体积的溶液PC，50℃水浴放置10min左右，使胶块充分 溶解。

4、 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

5、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

6、重复操作步骤5

7、将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm离心2min，将吸附柱置于室温，放置3min。

8、将吸附柱CB2放入一个新的离心管中，向吸附膜中间位置滴加30μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集DNA溶液。

5实验结果

l 正义链和反义链PCR扩增琼脂糖凝胶图

Marker: DL2000

Sense：正义链产物

Antisense：反义链产物

二．RNA-RNA pull down实验

1实验目的 ：通过RNA-RNA pull down实验，在细胞中获取与目的RNA有相互作用的RNA；并进行qPCR检测。

2实验材料

l 主要试剂

l 主要仪器及器材

3实验方法

l 体外转录&生物素标记RNA

1、取一支无RNA酶的EP管，加入表2-2的转录体系，37℃孵育35min。

表2-2 转录体系

2、取出孵育好的EP管，加入2µl的DNaseⅠ，37℃孵育15min，除去DNA。

3、取出上述操作的EP管，加入2µl 0.2M EDTA（pH=8.0）终止反应。

4、取3µg Biotin标记的RNA，加入适量Structure Buffer（10mM Tris pH=7.0，0.1M KCl，10mM MgCl2），使得RNA形成二级结构。然后将RNA 95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min。

l 链霉素亲和磁珠与生物素标记的RNA结合

1、磁珠准备：使用Wash Buffer I 500µl冲洗磁珠3次。

2、用Wash Buffer I（配方如表2-3所示）重悬磁珠，然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中，4℃过夜。

3、过夜的混合物3000rpm离心1min，去上清。

4 、Wash Buffer I冲洗3次。

表2-3 Wash Buffer 配方

l 磁珠复合物与RNA结合

1、往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液，裂解液中加入适量RNase*制剂抑**，室温旋转混匀1h。

2、将孵育好的磁珠-RNA置于磁力架上去除上清，使用Wash BufferII冲洗3次，每次1ml。

l RNA提取

1. Input样品及sense、antisense、beads 样本分别加入1ml TRIZOL, 颠倒混匀 15 s；

3. 13000 g、4℃离心 10 min，收集上层水相，转移到新无 RNA 酶离心管中；

4. 分别加入 5 µL 糖原（1ug/ul），500 µL 异丙醇充分颠倒混匀；

5. -80℃过夜沉淀 RNA 样品；

6. 13000 g、4℃离心 10 min，弃上清；

7. 分别加入 1 mL 预冷的 75%乙醇，10000 g、4℃离心 5min，弃上清，室温静置风干 10min；

8. 加入15ul DEPC处理水，溶解RNA。

l RNA反转录

1. 按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。

2. 按如下程序进行反转录：

37℃,15min；85℃，5sec；-20℃保存备用！

3． 定量PCR检测

1） 将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2） 冰上配制下表中的反应液

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

l 实验结果

qPCR检测结果(详细数据见附件excel” RNA RNA pull down 检测结果”)

项目内容

广州如期生物技术有限公司 成立于2016年，始终以探索科学、服务客户为己任；致力于为高校、科研院所、医院、制药企业提供全面、便捷、专业的技术服务和产品。技术方面我们专注于生物医学领域：公司拥有完善的技术服务平台，覆盖分子生物学，转录组学、代谢组学、蛋白组学，表观遗传等多个科研平台。在产品方面，自主研究多种类型科研试剂盒20多项，如：COIP、CHIP、RIP等科研检测试剂盒，较之同类型的进口试剂盒，极大的降低了科研成本。

公众号：如期生物

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