磺化PEEK确实可以在一定程度上提高材料的生物相容性，生物惰性较传统PEEK有了一定的改善，对细胞的增殖、黏附等能力也有提高，但较之理想的骨整合、骨传导及成骨诱导能力仍未达到我们希望的“理想型骨修复材料”的水平。

那么如何进一步加强磺化PEEK的生物相容性，则是下一步研究的重点。成骨材料的矿化能力也代表了材料本身的骨传导、骨整合能力；在很多研究中生物矿化就成了验证方法而存在。

正如临床工作中，运动医学科的关节镜以及镜检科的胃镜肠镜曾经都是以检查手段最先出现在临床工作中，但是随着医疗技术的进步，医学认知的提高，这些原本仅作为诊断手段存在的检查方法也已经成为了技术成熟的独立手术、操作技术。那么生物矿化是否可以作为提高磺化PEEK二次修饰手段则是下一步研究的主要方向。

生物矿化是一个无机离子与有机蛋白质分子以配位形式聚集的过程，即指生物体内无机元素在有机物的诱导和调控下，从周围特定的有机物上聚集形成矿物的过程。生物矿化最显著的特点是，细胞分泌的蛋白质、多糖和肽等生物分子通过生物分子的有序组装和有机相与无机相的相互作用，决定了具有特定形状、大小、取向和结构的矿物的形成。

目前，有三种不同的理论解释无机材料是如何系统地沉积的。第一个也是最重要的理论是在20世纪30年代提出的，被称为经典成核理论，它描述了如何通过动力学和热力学参数形成和控制组件。

在这里，单个离子结合形成一个有序的团簇，随后形成一个有序的晶格这个过程受到蛋白质分子的严格调控，这反过来有助于降低能量屏障，并有助于形成结构合理的初始成核离子团簇。

第二个模型，非经典成核理论，在成核的初始阶段存在预成核团簇，这些团簇被进一步同化形成非晶矿物相。

这些相以液态存在，并保持良好的水合状态。除蛋白质分子外，预成核的团簇对pH值也有很高的响应性。非晶矿物相最终转化为更高有序的晶体聚集体。这一理论的一个显著特点是，生物系统在实际晶体组装之前就已经报告了水合非晶矿物相的存在。

因此，很有可能生物系统可以利用这种非经典成核途径形成生物矿物。第三个假设是粒子附着结晶（CPA），是经典理论和非经典理论的结合。根据CPA，无定形或结晶矿物相是在与离子团簇、凝胶、低聚物、液相相互作用后形成的，最终形成较大的晶体组装体。

作为制备用于骨组织工程的含有有机-无机材料的仿生复合材料的有力方法，生物矿化技术可以再现骨的组成过程，从而支持骨形成并改善力学性能。随着纳米技术在20世纪80年代初的出现，人们对硬组织研究领域产生了极大的兴趣，目的是在体外模拟这种矿化物质的合成，从而对骨组织工程学及牙齿组织工程学的研究拓展新的思路。

体外进行生物矿化的常用研究方法包括：1：模拟体液（SBF）浸润；2：过饱和钙化溶液法；3：交替浸泡法；尽管不可能理解导致每种特定生物矿物形成的真实机制，但仍有一些常见的矿化控制策略，包括化学控制、空间控制、结构控制、形态控制和构造控制。

与人工合成的材料相比，通过生物矿化形成的材料通常具有更复杂的结构和层次结构，并因此具有优越的物理化学性质，以便在分子水平上调控生物矿物的纳米和微观结构。

例如，贝壳珍珠层中蛋白质和CaCO3有序排列结合了蛋白质的弹性和CaCO3的强度，使贝壳珍珠层具有优于许多人造陶瓷的硬度、强度和韧性。

有研究表明，在富含硫酸盐和羧酸基团的CS表面，这些基团可以通过结合带正电的钙离子从而加快HAP成核和生长。此外，生物体内的生理环境决定了生物矿物可以在温和和环境友好的条件下合成（接近中性的pH值、大气压、室温和水环境）。

简而言之，生物矿化过程结合了迷人的形态、优越的性能，这些都是材料合成吸引人的特征。因此，模仿生物矿化过程已经成为一种很有前途的有效策略，通过绿色和低能量的反应过程来设计和合成先进的无机和有机-无机复合材料。

本研究不仅在制备生物矿化修饰的SPEEK材料之前，本研究结合先前阅读文献，参考配制模拟体液的梯度浓度，即SBF、5倍SBF、10倍SBF。人体内不同组织液的pH值范围在5-8.5之间波动（胃酸的pH值甚至可以低于0.8），而不同pH值下模拟体液实际Ca/P比以及体液内OH-的多少均会对矿化过程造成影响，因此对pH值得讨论也是极有意义的。

通常成骨材料形成矿化物质的时间为3-4周，而高浓度的SBF可以加快这一反应，甚至仅在2h左右就可以在材料表面形成矿物质堆积。因此本研究对矿化时间的跨度及观察时间点进行了设定，期待能够通过这些时间点更透彻的了解磺化PEEK材料生物矿化的过程。

虽然先前的这些生物矿化研究并没有涉及PEEK材料，但是我们将浓度因素、化学因素、时间因素纳入到本研究中作为变量进行观察，可以很好地了解这些因素在生物矿化过程中的影响，并对后续PEEK材料结合生物矿化技术的应用提供参考。

细胞培养

人脐带间充质干细胞（HUMSCs）使用10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM-F12培养基，在温度37℃，5%CO2浓度的恒温培养箱内培养。培养皿内加入10ml培养基，每隔一天换液一次，并选取第三代细胞用于后续试验，多余经梯度冻存处理后，保存在液氮柜内。

浸提液细胞毒性检测

将矿化后筛选出的4组材料分别修剪成直径1cm厚度0.1mm的圆形薄片，每组5片，浸泡于5ml的DMEM-F12细胞培养基中，在37℃恒温培养箱内浸提24h。提取上清浸提液后过滤，取部分浸提液用DMEM–F12细胞培养基稀释为50%，其余原始浓度浸提液密封保存。

以每孔8×103个细胞的密度，将传至第三代的人脐带间充质干细胞接种于96孔板，再分别取初始浓度浸提液和稀释后的浸提液200µL加入每孔，以纯DMEM-F12细胞培养基作为对照组。培养24h后，于每孔中加入10µLCCK-8，并在37℃条件下孵育2h。利用酶标仪测定上清液在450nm波长处的吸光度值。

电镜观察及理化表征

本研究通过在生物矿化修饰过程中调整pH值、模拟体液浓度及矿化时间这三个因素，观察磺化PEEK材料在不同条件下生物矿化效果，根据扫描电镜的结果进行分析讨论，分析这三个因素在生物矿化过程中所起到的影响。

由于分组极多，文中仅选择部分典型电镜对比照片进行分析说明。如图3.2所示。图3.2-A可见随着pH值自5.4逐渐升高至7.4，相同矿化时间下，形成的矿化产物结构越紧密，这与pH值升高后，-OH的增多在生物矿化过程中影响物相转化。

但是当pH值上升至8.4时，矿化物的形态及范围较较低pH值组变小且稀疏。虽然pH值的升高提高了溶液中-OH，但是由于模拟体液本身为过饱和溶液，pH值得升高也导致了溶液溶解度的降低，部分离子析出沉淀，降低了溶液中Ca、P的浓度，影响了矿化反应的发生。

图3.2-B为矿化时间增加后矿化反应的进展变化。作为10倍SBF溶液，在pH值为6.4时，仅2小时就在SPEEK材料表面出现了少量的矿物沉积，这也说明了SBF的浓度提高有利于生物矿化的发生；随着时间的增加，形成的矿化产物数量与范围明显增加。

浸提液细胞毒性检测

生物矿化所用矿化液为不同倍数浓度的模拟体液，为了验证高倍数模拟体液制备的材料不会存在细胞毒性，本研究仍应用间接接触法进行测定评估。

如图3.6所示，浓度为50%和100%的浸提液培养24h后的细胞存活率情况，所有分组细胞存活率均>80%，说明细胞可以在材料表面正常生长存活。细胞毒性实验证明，生物矿化所形成的无机磷酸钙矿物质对细胞无毒性反应，本研究所合成的复合材料在后续的体内、体外实验均可安全使用。

细胞黏附实验

细胞在SPEEK材料及矿化处理后的各组材料表面的黏附情况。细胞培养1天后即可发现矿化处理后各组细胞粘附情况明显优于单纯磺化处理的SPEEK30组。

并且SP5-7.4组细胞1天时就已有很多细胞铺展明显。随着时间推移，在培养第3天时，矿化后各组的细胞即覆盖大部分的材料表面，而其中SP5-7.4和SP10-7.4两组细胞分布更均匀，细胞数量也更多。

这说明本研究通过矿化获得的磷酸钙层相较单纯的孔隙结构更有利于细胞的生长与铺展，这可能是磷酸钙为细胞提供了更多的附着点，从而使细胞更容易黏附于材料表面。而不同配比的矿化条件也说明了，在pH值为7.4时获得的复合磷酸钙层更有利于细胞铺展与黏附。