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转基因动物是目前生物技术研究中热点课题之一,自从1985年Hammer利用显微注射法将小鼠金属硫蛋白基因启动子与人生长激素基因融合的质粒导入到家兔原核胚的雄原核中获得了表达人类基因的转基因兔研究起，转基因兔为人类疾病的研究提供了新的模型动物。
目前，获得转基因动物的常用方法有原核注射法、逆转录病毒感染法、精子载体法、胚胎干细胞法和体细胞核移植方法，不管采用哪种方法进行研究,首先需要进行胚胎移植。
虽然一百年前Walter Heape就完成了兔的胚胎移植，但是移植胚胎的好坏、受体兔的优劣以及移植方法的选择均可能影响胚胎移植的效率,而胚胎移植是转基因克隆兔技术成败与否的关键一环,因此,为建立成功高效的转基因兔(采用慢病毒载体法)和克隆兔胚胎移植平台开展了本研究。
普通级新西兰白兔，雌性，6～8月龄，体重3～4.5 kg；雄性，7～1 0月龄，体重3.5～4.5 kg，南方医科大学实验动物中心提供。
均饲养在室温18～25℃、湿度40%～70%、按12/12h控制光照的普通环境中。所有动物的饲养管理和使用均得到南方医科大学实验动物管理委员会和实验动物福利和伦理管理委员会的许可，所有的动物实验均按照实验动物使用操作规程进行操作。
选择拟作供体的雌兔,用孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性激素PMSG+hCG(宁波第二激素厂)进行超数排卵:每只兔皮下注射PMSG 100 IU,注射后72～120 h进行配种,为确保成功排卵,配种后每只兔耳缘静脉注射hCG 150 IU。配种后18～24 h从输卵管冲出受精卵并收集到EBSS-complete胚胎培养液(HyClone)中，置于38.5℃、5%CO2、100%湿度的培养箱。
受精卵收集同1.2，应用显微操作系统将已包装并稀释好的慢病毒溶液注射到受精卵(图1A)的透明带下,操作完成后将胚胎移到EBSS胚胎培养液中,并置于培养箱中孵育20～30 min后进行胚胎移植。
从兔群中选择发情明显的雌兔作为受精卵和转基因胚胎移植的受体，对拟作受体的雌兔在对供体进行超数排卵的同时也同期发情处理，耳缘静脉注射hCG 150 IU，并用玻璃棒刺激阴道促使受体兔排卵。第2日，把受精卵或经注射慢病毒的受精卵移植到受体兔的输卵管内。
卵母细胞的获得参考刘亚等采用的PMSG+hCG超数排卵方案:选择拟作供体的雌兔,每只兔皮下注射PMSG 100 IU,96 h后耳缘静脉注射hCG 150 IU,13 h后从输卵管内冲出卵母细胞和卵丘细胞团，将细胞团收集到培养液中，最后将所有的细胞团用透明质酸酶消化3 min使得卵母细胞与颗粒细胞分离呈单个细胞，收集卵母细胞置于培养液滴中，将消化液离心并用培养液洗涤两次，收集新鲜的颗粒细胞。
克隆胚胎(图1B)的制备方法参考Pa tr ic k C h e s n e，但略有不同，本实验采用Spindle view系统辅助去核代替荧光去核，操作方法如下:①在纺锤体观测仪辅助的显微操作系统下完成卵母细胞去核，完成一批卵母细胞去核后去掉Spindleview过滤光，在正常滤光下完成去极体;然后用注射针吸取颗粒细胞沿针口注射到透明带下，每个细胞注射一个供体细胞，形成一个卵丘-卵母细胞复合体(COCs);
②将复合体进行电融合，融合参数如下:直流电3.0 KV/cm,20μs,3次，每次间隔1 s。电击后将复合体移入EBSS-complete胚胎培养液中洗涤三次后置于胚胎培养箱内培养;
③电击融合后置于培养箱内培养约60 min后，对融合的复合体进行激活，即按照融合时的方法和参数进行第二次电击，电击后将克隆胚胎移入含5μg/ml CHX和2 mmol/L 6-DMAP的激活液中培养60 min，最后移入四孔板装的EBSS-complete胚胎培养液，置胚胎培养箱内继续培养16～17 h后移植到代孕兔的输卵管内。体细胞核移植胚胎的代孕兔在供体兔注射HCG 22 h后耳缘静脉注射150 IU的HCG促其排卵，1 3 h后进行胚胎移植。
按1 ml/kg给新西兰兔经耳缘静脉注射3%的戊巴比妥钠实施麻醉，待兔的痛觉反射消失后，用异氟烷呼吸麻醉进行麻醉维持。将兔侧卧保定于手术台上，以侧腹部为中心剪毛(图1C)，消毒，铺上无菌手术垫布并固定。
选择在距脊柱约5 cm与距肋骨5 cm的交叉点为术野中点，与脊柱平行处开一个2 cm的切口，依次切开皮肤、筋膜、肌肉层和腹膜，小心暴露输卵管，并观察卵巢是否有排卵点，若有3个以上即可作为合适的受体兔。
此时，将胚胎装到胚胎移植管(Tom Cat Catheter,Tyco,Mexico)中:先吸取2 cm长的培养液,再吸取0.5 cm的气泡,然后将胚胎连同尽可能少的培养液吸进移植管,接着是另一个气泡，最后是1 cm的培养液。
操作者用小弯镊轻轻捏住输卵管伞，移植管从输卵管伞口轻轻插入，助手用平滑镊子轻轻拨动输卵管使之伸直以便移植管顺利插入(图1D)。把移植管伸入3～5 ml后(壶腹部)再稍往后退，助手将胚胎缓慢注入输卵管内，边注射边将移植管缓慢移出。
胚胎注射结束后，用小镊夹着系膜将输卵管伞端提高，并将胚胎往子宫方向拨动，小心将输卵管纳回腹腔。
清除腹腔内的污血等异物，清点手术器械，并检查腹腔内无出血后，用预热的灭菌生理盐水冲洗干净，连续缝合腹膜和肌肉层，肌肉层缝合结束后撒上青链霉素，然后结节缝合皮肤，结束后用碘酊消毒伤口。
如需双侧移植则将兔翻转后按上述方法继续移植。手术结束后，肌肉注射青链霉素各5万单位，将受体兔放到笼中单独饲养，并做好保暖工作。
发育到期率和活胎率组间差异采用卡方检验。
经用激素进行超数排卵处理后配种的兔每只能获得20～30枚受精卵。将48枚处于2～4细胞期的受精卵移植到3只受体母兔的输卵管内继续发育,移植15 d后通过摸胎法检测到3只受体兔怀孕,妊娠率为100%;
在第31日时产下21只仔兔,妊娠到期的胚胎率为43.75%,活胎19只，活胎率为90.48%(表1)。其中1只代孕兔的双侧输卵管分别移植6枚胚胎，妊娠到第31天时全部胚胎发育到期自然分娩产下12只仔兔。
表1 兔胚胎移植结果
图1 兔胚胎操作及移植结果
将122枚处于原核或2～8细胞期的转基因胚胎移植到6只受体母兔的输卵管内继续发育，4只受体兔怀孕，妊娠率为66.67%;妊娠到期产下26只仔兔，妊娠到期的胚胎率为21.31%，活胎24只，活胎率为92.31%(表1)。
其中1只代孕兔的双侧输卵管分别移植7和8枚胚胎，妊娠到第31天时全部发育到期并自然分娩产下15只仔兔，1只代孕兔单侧输卵管移植5枚胚胎，妊娠到第31天时全部发育到期自然分娩产下5只仔兔，妊娠到期的胚胎率和活胎率达100%;1只代孕兔在第31天时经剖腹产下1只活胎及2只死胎。经检测其中6只为阳性，基因整合率达23.08%(数据没有显示)(图1E)。
经超数排卵后的兔平均每只能获得25枚卵母细胞。将199枚处于2～8细胞期克隆胚胎移植到11只受体母兔的输卵管内继续发育,4只受体兔怀孕,妊娠率为36.36%;妊娠到第31天时经剖腹获得17只仔兔,妊娠到期的胚胎率为8.54%,活胎3只,活胎率为17.65%(表1),但成活个体均在3 h内死亡(图1F)。
雌性供体兔只要达到性成熟就可以进行超数排卵实验，但是与达到体成熟后的供体兔相比，前者获得的卵母细胞在数量上与后者没有区别，甚至比后者多(前者平均能获得30枚以上的卵母细胞，后者通常获得25枚左右，这可能是兔刚性成熟，对激素敏感度更高的原因)，而后者的卵母细胞的质量明显优于前者。
主要体现在透明带厚，卵周隙宽，细胞质的颗粒感强，并且易于进行核移植操作，操作成功率高，胚胎发育好，而这些为胚胎移植成功提供了最基本保证。3.1.2雌性受体兔的选择受体兔选用6～8月龄，体重3.0～4.5 kg的个体大的经产母兔较好，一方面其输卵管粗大且直，胚胎移植管容易通过。
在进行胚胎移植时能减少对输卵管的刺激和损伤，另一方面经产母兔的子宫曾经有过胚胎着床，这种环境可能有利于移植胚胎的着床和发育，不仅如此，经产母兔的母性较好，有利于仔兔的自然分娩和哺乳，从而提高胎儿成活率。
在进行胚胎移植手术时需要检查受体兔的排卵情况，通常输卵管鲜红、卵巢出现3个排卵点母兔为较合适的受体兔，在实验中作者曾多次遇到代孕兔的输卵管的颜色较浅，或者卵巢无排卵点，或者卵巢形状异常的受体兔均没有妊娠。
目前,许多研究者采用FSH+h CG或PMSG+hCG的方案进行超数排卵，由于FSH+hCG在操作上比较复杂，因此作者采用了PMSG+hCG的方案。报道中多用80 IU的PMSG和100IU的hCG，而本实验中发现100 IU的PMSG和150 IU的hCG效果更好，这可能与本实验选择的供体兔的个体大有关。
作者还发现选择处于发情间期或前期的雌兔进行超数排卵效果较好，可能是因为这两个时期用外源激素干预兔的激素水平有利于卵泡的发育，这与刘牧等报道的处于发情期和发情后期的兔进行超排效果较好的结论不同。
由于兔性成熟后一年四季均可交配繁殖，母兔的发情周期为8～15 d，发情持续时间为2～3 d，因此在注射PMSG 72～120 h左右母兔处于发情期时进行配种比较适宜。
兔又是属于典型的刺激性排卵动物，雄兔的交配动作和静脉注射绒毛膜促性腺激素均可诱导母兔排卵，所以为确保母兔及时排卵、成功受孕,在母兔配种后还需对配种供体兔耳缘静脉注射hCG。
母兔在配种后10～13 h开始排卵,在配种后18～20 h时收集的胚胎多处于原核胚或2-细胞期，24～28 h时收集的胚胎多处于4-细胞期，这跟张金友等的研究结果相同,但与林峰等的研究有些差异，这可能与选用的兔的品种和年龄段有关。本实验的数据为把握移植时机提供了依据。
兔胚胎对体外培养环境非常敏感，体外培养时间过长可能会引起胚胎发育异常，不利于胚胎着床从而导致实验失败。
受精卵是自然交配后从体内直接冲出再移植到代孕兔体内，受人为因素影响少，但在进行受精卵移植的前期，由于实验设计不成熟，作者曾将冲出的受精卵用细胞输送箱经运输1 h到另一实验场地之后才进行移植，移植的受体兔均没有怀孕;
直到改进实验设计，不再经运输并且在半小时内将胚胎移植到代孕母兔体内后才获得了胚胎移植的成功;原因可能有两个，一是受精卵在体外环境的时间越长，越不利于胚胎的发育;二是受体兔的同步程度不高以致胚胎跟输卵管的生理状态不相配而导致不孕。
此外，在实验中作者曾经将一只雌兔经超数排卵后配种收集到的50枚胚胎全部移植到一只受体兔的两侧输卵管内未见胚胎发育到期，而实验中妊娠的受体兔移植的胚胎却大多数是只移植了12～18枚。
赵建军等研究表明,移植过多的胚胎反而会降低受胎率和产仔数，只有适合的数量(约15枚左右)的胚胎才能获得较好的受胎率，原因可能是移植的胚胎数量多引起相互竞争营养而影响胚胎的发育，这跟Besenfelder和ChallahJacques报道也相近。
通过上述方法，基本掌握了稳定的超数排卵以及成功率较高的受精卵移植技术，为进一步研究转基因兔和克隆兔奠定了基础。