作者︱邢肖伟 陈艺兵 来源︱Bio-protocol第三届生物实验短视频大赛
肠道是哺乳动物机体最大的免疫器官，其固有层分布着各类免疫细胞对抗食源性抗原物质，维持免疫防御和营养吸收的动态平衡 ，分离小鼠小肠固有层单细胞应用于流式细胞等检测已经成为研究小鼠小肠免疫功能的重要手段，小鼠小肠结构复杂，需要先解离上皮细胞再进行消化，对于消化条件的摸索对固有层细胞表面抗原表达的完整性非常重要，在这里我们 采用三种酶混合消化法恒温振荡消化，用时较短也能较好的保留细胞表面抗原 ，细胞获得率高，便于进行后续检测，为一种简便易行的实验方案，供有此实验需求的老师同学们参考。
一、实验材料与试剂仪器
1. 动物
C57BL/6J雄性小鼠
2. 试剂和耗材
试剂：
胎牛血清（FBS）
胶原酶IV（collagenaseIV）（sigma）
分散酶（Dispase）（Roche）
DNA酶I（DNaseI）（Roche）
PBS
RPMI1640
耗材：
50 mL离心管
10 cm培养皿
40 μm及100 μm一次性细胞筛
冰板
手术器械：直镊、弯镊、眼科剪、直头灌胃针、20 mL注射器、1 mL注射器
3. 仪器和软件
水平离心机（Beckman）
恒温震荡摇床（crystal）
二、实验操作
小鼠小肠固有层单细胞提取
该作品在Bio-protocol第三届生物实验短视频大赛中荣获优秀奖，欢迎访问网站查看原视频: https://s.bio-protocol.org/bf1761bd5d1ce670
1. 小鼠的麻醉、固定及取血
用干冰（CO₂）麻醉成年小鼠（例：C57BL/6），随后用75%酒精消毒后固定于泡沫手术板上，使用镊子分离腹部皮肤和腹腔内容物并用弯头皮剪打开小鼠腹腔，剪开胸腔隔膜并用1ml注射器取出小鼠血液以减少后续操作的血细胞残留及干扰；
2. 小鼠小肠组织的剥离
找到盲肠部位，确认盲肠上端回盲部，在此处用直镊和弯镊钝性分离小鼠小肠和肠系膜组织，一只手持弯镊固定小肠，另一只手持直镊，以直镊尖端镊住肠系膜组织和小肠连接边缘处，反向剥离组织并小心避免对肠壁的破坏，保持小肠的完整和干净；
3. 小鼠小肠组织的预处理
将分离出的小肠置于预冷的PBS中（10 cm培养皿），用20 mL装有直头灌胃针头的注射器吸取20 mL预冷的PBS对小肠进行正反向冲洗，将冲洗完成的小肠展平铺于PBS浸润的吸水纸上（4℃冰板上操作），用眼科剪小心剔除小肠上多余的肠系膜脂肪组织及存在于小肠壁上的派氏淋巴结（凸起不透明类圆形结状物）；
4. 小鼠小肠组织的洗涤
将小肠放回10 cm培养皿的PBS中，纵向剖开并剪碎，剪成约1 cm左右的肠段，在吸水纸吸干水分并放入50 mL离心管，加入15 mL清洗缓冲液（PBS+3%FBS），vortex 1 min去除小肠黏液和残余内容物，倒入干净的10 cm培养皿，取出小肠组织并吸干水分；
5. 小鼠小肠组织的预消化/上皮细胞解离
将吸干水分的小肠置于新的50 mL离心管，加入15 mL解离液（PBS+3%FBS+1 mM EDTA+1 mM DTT）置于恒温震荡摇床37℃ 250 rpm 水平震荡预消化15 min；
6. 消化液配制及小鼠小肠固有层的消化分离
（各消化酶提前溶解分装成浓度及体积合适的储液储存于-80℃或-20℃冰箱待实验前取出融化使用）利用小肠预消化15 min内新鲜配制消化液：RPMI1640 + 3%FBS + 0.2mg/mL collagenaseIV + 0.1 mg/mL DNaseI + 1 mg/mL DispaseII，取出预消化完成的样品倒入干净的10 cm培养皿，用镊子捞出组织块用PBS洗涤2次（目的：洗去残余EDTA和DTT避免影响后续酶消化效率）后吸除多余水分置于50 mL离心管中，加入20 mL配制好的消化液，37℃恒温摇床250 rpm震荡消化25 min，消化完成后4℃ 400 x g离心8min沉淀细胞，弃上清，15 mLPBS重悬沉淀并过筛（依次用100 μm和40 μm滤膜过滤），滤液4℃ 400 x g离心8 min，弃去上清后加入1 mL破红液重悬并移至2ml离心管，破红后4℃ 400 x g离心3 min，弃上清，PBS重悬洗涤一次，再用PBS+3%FBS重悬即可用于后续流式染色等实验检测。
三、注意事项
1. 小肠组织的预处理部分 尽可能细致完全地剔除附着于小肠的肠系膜脂肪组织 ，因为脂肪细胞的存在会严重影响细胞消化结果及活率；也应 尽可能剔除派氏淋巴结 ，其富含大量以B细胞为代表的免疫细胞可能会干扰实验结果的准确性；
2. 小肠的洗涤和预消化部分可根据实验者个人经验、实验条件以及所用小鼠品系、造模方式等因素， 适当增加洗涤/消化的次数或延长时间以获得最佳实验结果 ；
3. 消化液所用酶均为提前配制的储液重新稀释而成，不同厂家不同批次酶的活性可能略有不同， 如果消化效果不理想可自行摸索调整至适当浓度，酶配制成储液后应置于-80℃或-20℃冰箱保存，不应反复冻融，需在分装时提前计算好每次用量和浓度 ；
4. 一次不应同时操作太多样品，2-4只较为合适 ，样品太多前后操作时间容易引入不同组之间操作上的误差，难以保证实验的效果。
四、作者及单位简介
作者简介
邢肖伟 ，中国医学科学院药物研究所直博生。
陈艺兵 ，中国医学科学院药物研究所博士生。
单位简介
中国医学科学院药物研究所 （以下简称“药物所”）成立于1958年8月，隶属于中国医学科学院北京协和医学院。药物所是我国高级药学人才的培养基地。已培养硕、博毕业生2000余名。药学学科为国家教育部批准的一级重点学科，在2017年全国第四轮学科评估药学学科评估中名列榜首（A+），进入世界“一流学科”建设行列。2022年药学再次入选第二轮“双一流”建设学科名单。
五、参考文献
Bang, Y. J., Hu, Z., Li, Y., Gattu, S., Ruhn, K. A., Raj, P., Herz, J., & Hooper, L. V. (2021). Serum amyloid A delivers retinol to intestinal myeloid cells to promote adaptive immunity. Science (New York, N.Y.), 373 (6561), eabf9232. https://doi.org/10.1126/science.abf9232
Bio-protocol 简介
Bio-protocol于2011年在斯坦福大学创建, 致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。 Bio-protocol 期刊是Bio-protocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今， Bio-protocol 已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的5000多篇实验方案，并且同 Science 、 eLife 等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年 Bio-protocol 期刊已被PubMed Central，ESCI收录。