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乳酸脱氢酶是糖代谢途径中一个非常重要的酶，而大多数已知的体内寄生虫能量代谢的主要途径是无氧糖酵解。
基于LDH的高度保守性，调取细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的LDH-A和LDH-B的蛋白序列进行序列比对，探究其与在生物学上的特性，为进一步研究研究其功能提供参考。
方法
Egldh-A、Egldh-B、Emldh-A和Emldh-B核苷酸序列扩增及鉴定从公共数据库调取Egldh-A（JN627488）、Egldh-B（CDS18561）、Emldh-A（LK028578）和Emldh-B（CUT99280）[46]的核酸序列，根据序列设计引物（表1）进行扩增，扩增产物送上海华津生物科技有限公司进行测序。
分别以细粒棘球蚴和多房棘球蚴的cDNA为模板，第一轮PCR扩增得到了分子量大小正确的Egldh-A和Emldh-A的核酸片段，测序结果显示该序列为正确的目的基因（引物见表1）；但扩增得到的Egldh-B和Emldh-B的核酸片段与已知的cDNA不吻合，将PCR产物测序后，利用测序的结果寻找完整的ORF并设计引物重新扩增（引物见表2）。
PCR反应体系（25μl体系）：2×PCRMastermix12.5μl，cDNA1μl，正反引物各1μl，ddH2O9.5μl。PCR反应参数为：预变性：95℃，5min；变性：94℃，30s；退火：55℃，30s，延伸：72℃，1min，共设置35个循环。
ldh基因编码蛋白的序列分析
蛋白质的理化性质主要包括： 相对分子质量（Molecularweight,MW）、等电点（isoelectricpoint，pI）、二硫键（S-S）等。以上提及的理化性质需要利用不同的分析工具如在线网站以及软件分析预测得到，例如最常用的多功能综合序列分析软件DNAStar、DNAman等，本实验利用DNAstar的内含组件Editseq预测分析得到了蛋白质的相对分子质量、等电点等相关理化性质。
可通过网站http://metaldetector.dsi.unifi.it/在线预测分析蛋白质结构中是否存在二硫键；预测可通过网站http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl在线来预测分析蛋白质的亲水/疏水性质；利用在线网站http://www.ebi.ac.uk/interpro/进行结构域分析预测；利用在线网站https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSA/进行酶活性位点分析；利用在线网站http://www.iedb.org/分析蛋白的抗原表位。
同源序列比对与分子进化树构建
将EgLDH-A（AFA35122）、EgLDH-B、EmLDH-A（CUT99509）和EmLDH-B与其他物种的LDH进行比对，这些序列分别是：
HomosapiensA(NP_001158886),HomosapiensB(NP_001302466),HomosapiensC(NP_002292),Caenorhabditiselegans(NP_496503),Drosophilamelanogaster(NP_476581),SchistosomajaponicumA(CAX70888),SchistosomajaponicumB(AAO59420),Schistosomamansoni(XP_018655219),Clonorchissinensis(AAV80238),TaeniasoliumA(ADV35656),TaeniasoliumB(ADV35657),EchinococcusgranulosusA(ADK25713),EchinococcusgranulosusB(CDS18561).
EchinococcusmultilocularisA(CUT99509),EchinococcusmultilocularisB(CUT99280),HymenolepismicrostomaA(CDS26883),HymenolepismicrostomaB(CDS32958),Toxoplasmagondii1(XP_002368105),Toxoplasmagondii2(XP_002368488),Plasmodiumfalciparum(XP_001349989),Babesiabovis(XP_001611047),Trichomonasvaginalis(XP_001327792)，括号中为GenBank序列号。
利用MEGA7.0（最大似然法）和GeneDoc软件完成分析和整理多序列比对及分子进化树结果。
结果
Egldh-A、Egldh-B、Emldh-A和Emldh-B的序列扩增及鉴定
重新设计引物后PCR产物的核酸电泳结果显示， 条带大小与Egldh-A、Egldh-B、Emldh-A和Emldh-B序列大小相符 （图2）。测序后的核酸序列及翻译的氨基酸序列见图3。新发现的Egldh-B和Emldh-B基因应用于以下整个实验中。
Egldh-B和Emldh-B克隆完成后，将其氨基酸序列与EgLDH-B（CDS18561.1）和EmLDH-B（CUT99280.1）进行序列比对，发现四段序列的前330个氨基酸有极高的同源性，且EgLDH-B和EmLDH-B仅有四个氨基酸序列的差异。
此外发现EgLDH-B和EmLDH-B与EgLDH-B（CDS18561.1）和EmLDH-B（CUT99280.1）所造成的不同是由于EgLDH-B和EmLDH-B在氨基酸332时终止了表达，与其他LDH相同，均只有996bp核苷酸翻译为氨基酸（图4）。
LDH蛋白理化特性预测Egldh-A[9]和Emldh-A已有研究，Egldh-B和Emldh-B为本实验室新发现的序列，全长均为996个核苷酸， 起始密码子ATG，终止密码子TGA， 编码331个氨基酸，四个蛋白的理化性质见表3。
抗原表位预测
应用在线预测网站分析预测EgLDH-A、EgLDH-B、EmLDH-A和EmLDH-B氨基酸序列的抗原表位，结果显示EgLDH-A和EmLDH-A的抗原表位主要分布在第21-33，52-59，79-89，150-158，189-200，215-228，306-314位；EgLDH-B和EmLDH-B的抗原表位主要分布在第13-22，53-59，77-87，151-159，178-198，208-228，307-317（图5）。
二硫键及亲疏水性分析
经过网站分析结果发现EgLDH-A、EgLDH-B、EmLDH-A和EmLDH-B均无二硫键存在；应用网站分析推导EgLDH-A、EgLDH-B、EmLDH-A和EmLDH-B氨基酸序列的亲水性， 四个蛋白在第25-50位、125-150位及280-305位三个区域的亲水性最高 （图6）。
结构域和功能域分析
InterProScan扫描结果显示EgLDH-A、EgLDH-B、EmLDH-A和EmLDH-B氨基酸序列N端和C端中均含有乳酸脱氢酶保守功能域，在EgLDH-A和EmLDH-A位于第21-159位(N端)和第l62-327位(C端)，在EgLDH-B和EmLDH-B位于第20-l59位(N端)和第l62-325位(C端)。四个蛋白在第l89-l95位间都 具有乳酸脱氢酶的活性位点 （图7）。
同源序列分析
将EgLDH-A、EgLDH-B、EmLDH-A以及EmLDH-B与已知的其他寄生虫及模式生物的LDH氨基酸序列进行多重同源序列比对，比对结果见图8。
结果显示，以EgLDH-A序列为参考序列，所有物种共有的保守位点分别位于29（G）、51（D）、95（A）、105（R）、108（L）、112（N）、137（N）、165（D）、168（R）、177（L）、193（G）、291（P）、298（G），其中105（R）及165（D）是LDH的关键催化位点。
此外，发现EgLDH-B和EmLDH-B比EgLDH-A与EmLDH-A多一个NAD+结合位点，即28-30（Gly，Ser，Val），且与EgLDH-A与EmLDH-A的NAD+结合位点53（Asp）、56（Arg）、94（Thr）相比，EgLDH-B和EmLDH-B的相应的NAD+结合位点变为了53（Asn）、56（Lys）、94（Ala）。
不同物种LDH氨基酸序列之间的同源性结果表明， EgLDH-A与EmLDH-A同源性最高为94%， 与EgLDH-B和EmLDH-B的同源性均为59%（EgLDH-B与EmLDH-B的同源性为99%），与阴道毛滴虫LDH（TvLDH）同源性最低为25%，与人LDH的同源性为50-53%。
分子进化树的构建及分析
应用MEGA软件将包括寄生虫和模式生物的22个物种LDH的氨基酸序列进行比对后构建分子进化树（图9），结果显示细粒棘球绦虫LDH与多房棘球绦虫、猪带绦虫及微小膜壳绦虫LDH均源于同一祖先。
四个物种乳酸脱氢酶的相同亚型归于一支，其中细粒棘球绦虫LDH与多房棘球绦虫LDH的进化关系最近；此外EgLDH-A、EgLDH-B、EmLDH-A和EmLDH-B与吸虫的LDH的进化关系较近，与原虫的LDH进化关系较远。
讨论
本实验室从细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫原头节cDNA文库中克隆了乳酸脱氧酶全长cDNA序列并对已有的Egldh-B与Emldh-B的序列进行了更正。扩增后测序得到的结果显示Egldh-B和Emldh-B的完整ORF均包括996个碱基，比GenBank提供的cDNA少100-300个碱基，猜测原始数据在预测过程中发生了错误。
表达四个蛋白的基因全长均为996bp，编码331氨基酸，EgLDH-A、EgLDH-B、EmLDH-A和EmLDH-B的理论分子量均约为35.5kDa，等电点（pI）分别为6.10，6.82，7.59和7.16。
蛋白质结构域和功能域分析结果显示 四个蛋白均含有LDH的完整结构域和功能域， 表明其均为正确的序列，而且可正常发挥LDH的作用，可用于后续的分析以及蛋白表达及功能研究。
此外，蛋白质的二硫键分析结果表明，四个蛋白均不含二硫键，有利于蛋白质的可溶表达。
对EgLDH-A、EgLDH-B、EmLDH-A和EmLDH-B氨基酸序列进行的生物信息学分析结果表明，EgLDH-B与EmLDH-B氨基酸序列同源性高达99%， 推测二者具有相似的结构特征和分子特性。
以EgLDH-A为参照，EgLDH-A与EmLDH-A氨基酸序列同源性最高为94％，与原虫LDH(PfLDH、TgLDH、TvLDH)的同源性(25-29％)明显低于其它物种(49-85％)，具有所有物种LDH共有的保守位点，在这些共有位点中105位精氨酸(Arginine,R)及165位天冬氨酸(Asparticacid,D)是LDH关键催化位点。
此外，EgLDH-B和EmLDH-B比EgLDH-A和EmLDH-A多一个NAD+结合位点以及另外三个位点的差异，推测可能会导致两个不同亚型的蛋白的结构发生改变，进而影响其功能。
构建的分子进化树显示，EgLDH与EmLDH在进化上属同一分支，与其它物种相比，其进化地位比CeLDH、DmLDH高，更接近于人类，与HsLDH-B在进化距离上最近。 说明LDH相关位点及酶活性位点高度保守，是一个合适的研究物种进化的分子。
EgLDH-A、EgLDH-B、EmLDH-A和EmLDH-B的氨基酸序列亲水性分析和抗原表位预测的结果表明，虽然四个蛋白的同源性有差异，但在序列的大概相同的位置可能有七个可能的抗原表位。
将四个蛋白抗原表位的氨基酸序列与其它物种LDH相同区段的氨基酸相比较，其与TsLDH的抗原表位序列有极高的相似性，预测若用EgLDH-A、EgLDH-B、EmLDH-A或EmLDH-B作为诊断抗原可能会与猪带绦虫造成较高的交叉反应，且该诊断抗原无法区分细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫感染，而与原虫PfLDH、TgLDH、TvLDH的氨基酸序列差异明显。
综上所述， 本研究通过序列分析和扩增，发现了棘球绦虫ldh-B的完整表达序列。
同时发现Egldh-A、Egldh-B、Emldh-A和Emldh-B是高度保守的功能基因，与其它物种LDH拥有共同的保守位点及催化位点，但EgLDH-B、EmLDH-B与EgLDH-A、EmLDH-A在辅酶结合位点存在不同。
并且，EgLDH与EmLDH属同一起源，其进化地位较秀丽杆线虫、果蝇为高，与原虫LDH的进化距离较远。EgLDH-A、EgLDH-B、EmLDH-A和EmLDH-B序列的生物信息学分析为进一步进行该基因的克隆、表达和功能研究提供了理论依据。
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