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云生信学生物信息学
微生物是一群 以分解代谢 为主的生物类群，其生物活性十分丰富。根据微生物的生物特性，从物种、生理代谢类群以及遗传背景几个方面探讨微生物多样性的问题，使人们更加了解微生物的多样性。目前， 16S rRNA基因测序 已经成为当前研究微生物群落组成和分布的重要手段。
01 什么是16S rRNA？
16S rRNA是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分，长度约为1542nt，具有 高度的保守性和特异性 。16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。 16S rRNA基因包括保守区和可变区 ，保守区反映了物种间的亲缘关系，而可变区则反映了物种间的差异。这两个区域呈交替排列，保守区可用于设计通用引物进行目的片段的扩增，通过对高变区的分析可以辨别细菌种类。
02 可变区域的选择
原核16S rRNA序列包含 10个保守区和9个高变区 ，没有任何一个可变区可以准确的将所有种类的细菌从域到种进行明确分类，而且一些可变区可以可靠的预测到特定的分类水平。不同的V区会对原核微生物群落结构的分析结果产生明显的影响。
V1-V3 （长度525bp），454平台
V3 （长度~200bp），illumina Miseq平台（PE125）
V3-V4 （长度464bp），illumina Miseq平台（PE300），该平台可完整覆盖该区域，对细菌的覆盖率较高[常用] 。
V4-V5 （长度~303bp），illumina Miseq平台（PE250）， 其特异性较好，具有很好“捕捉”细菌多样性的能力，数据库信息全，是细菌多样性分析注释的最佳选择 [最佳] 。
V4-V6 （长度540bp+），454平台，与16S rRNA基因全长结果相似
V7-V9 （长度~300bp），illumina Miseq平台（PE250）
03 每组测多少个样本可以满足分析
样本的重复 对于测序的实验设计以及后续的信息分析都很重要，当有异常样本存在的时候，会影响测序结果的准确性， 通过后续信息分析可以发现异常样本，需要将其排除 。
一般个体之间差别较小 的模式动物例如大鼠，小鼠，和兔子， 建议每组至少5个生物学重复，推荐每组有10个生物学重复 。
对于个体间差别较大的 ，例如人类肠道粪便样本，需要加大取样量， 每组不少于30个 。
04 测序的实验流程
样本DNA提取；指定区域进行PCR扩增；文库制备，质检和定量；随后进行测序。
05 常见的分析流程
05 常见的概念
OTU 是在系统发生分析或群体遗传研究中的一个 假定分类单元 。一般来说 97%相似度聚类为一个OTU ， 每个OTU对应一个种/属 ；从每个聚类的OUT挑选出一个代表序列做后续的分析。聚类分析后，会对OTU进行注释，获得具体的物种分类。
Alpha多样性指的是一个 特定区域或生态系统内的多样性 ，反应样本中 微生物丰度和均匀度的综合指标 。其中，稀释曲线反应取样大小是否合理。
Beta多样性 是对 不同样本/不同组间样本的微生物群落构成 进行比较分析。
差异分析（LEfSe分析） ，包括 LDA值分布柱状图 和 进化分支图。
06 结果主要包括的内容（基础类）
- OTU的检测结果 ，主要关注丰度前10的变化情况；注释以后，主要看门和属水平的菌群，观察其分布组成。
- 多样性结果 ，Alpha多样性观察组间是否有多样性差异，Beta多样性观察不同组是否显著分离。
- LEfSe分析 观察组间显著差异的物种。