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共培养条件下群体感应系统对乳酸菌产细菌素的研究进展

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是革兰氏阳性细菌，在食品工业领域具有很强的应用潜力。

目前，国内外对于各类乳酸菌产生的细菌素(Bacteriocin)的相关机制及影响因素的研究较为广泛，尤其是由乳酸链球菌所产生的Nisin已经于1969年被世界卫生组织确认为食品防腐剂。

但是，在纯培养条件下乳酸菌细菌素的产量过低、稳定性较差，这些限制了其大规模应用的可能，只有乳酸链球菌素Nisin通过了FDA认证并进行生产和使用。

因此，利用共培养技术提高乳酸菌细菌素产量的研究引起了人们的广泛重视，已有研究表明，群体感应(Quorum sensing)系统在乳酸菌共培养的过程中发挥了极为重要的作用，且三组分系统在其中发挥了重要作用。

但由于共培养菌株之间复杂的作用关系和群体感应基因的复杂多样，目前还没有一套通用的调控系统应用到细菌素的生产中，而具体的共培养诱导乳酸菌产细菌素的相关机制的研究仍处于初级阶段。

本研究在查阅文献资料的基础上，对乳酸菌细菌素的分类、生物合成机制以及群体感应系统对乳酸菌共培养促进作用的研究进展一一进行阐述，为今后相关的研究提供参考，并有望促进乳酸菌细菌素在工业领域的应用发展。

乳酸菌细菌素分类

细菌素是在乳酸菌核糖体中形成的次级代谢产物，能够抑制同种或相似种属细菌活性的蛋白质或多肽。

细菌素对目标微生物具有较强的针对性，可对多种致病性细菌产生高效的抗菌活性，如乳酸链球菌素。

目前乳酸菌细菌素的分类尚未有统一标准，根据2005年COTTER等修订的分类方法，以细菌素的分子量大小、结构、热稳定性等的不同，将其分为3类：分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类乳酸菌细菌素。

Ⅰ类乳酸菌细菌素为羊毛硫抗生素(Lantibiotic)，是含一个或多个氨基酸残基的多肽，根据其肽链的特异性划分为包括乳酸链球菌素(Nisin)在内的11个亚类。

Ⅱ类乳酸菌细菌素为非羊毛硫抗生素(Non-lantibiotic)，是不带有修饰的氨基酸残基。

另分为4小类：a类为片球菌素(Pediococin)。

b类是由两种不同的肽链组成的双链肽分子，这类细菌素需要两条肽链协同作用才能使这类细菌素发挥作用。

c类含环状，由N-末端和C-末端共价结合形成。

d类为非片球菌素单一线性肽，由不同的细菌素和单肽链非片球菌素组合形成。

Ⅲ类乳酸菌细菌素是一种高分子量，热稳定性差的细菌素，是一种具有易位功能的区域性大分子抗菌蛋白，也被称为溶菌素(bacteriolysins)。

细菌素的生物合成由多基因调控，因细菌素的种类不同，这些基因一般分布于生长素生产菌株的染色体或质粒上，并且调控细菌素产生的基因簇结构复杂多样。

目前为止，相关研究较多且生成和作用机制明确的只有Ⅰ类和Ⅱ类细菌素。

乳酸菌细菌素的生物合成机制

乳酸菌细菌素的生物合成由相关基因调控，包括编码基因、ABC转运蛋白基因以及与细菌素运输相关的辅助蛋白基因等。

Ⅰ类细菌素中乳酸链球菌素(Nisin)生成机制研究较为深入。

Nisin的生成通过多基因进行调控，这些基因被分别命名为nisABTCIPRKFEG，其中nisA对Nisin的前体多肽进行编码；nisB编码生成细菌膜上丝氨酸脱水酶(Serine dehydratase)，从而使丝氨酸和苏氨酸脱水生成脱氢丙氨酸和脱氢酪氨酸；nisT编码可使多肽穿过细胞膜的ABC转运蛋白(Transporter)。

nisFEG同样编码一种ABC转运蛋白，nisFEG自身编码的蛋白nisFEG能够识别Nisin的C-末端氨基酸，在ABC转运蛋白将Nisin转出膜外的同时阻止Nisin进入细胞内；nisC编码一种环化酶，使脱水残疾与半胱氨酸结合形成环。

nisP编码一种裂解Nisin中N-末端前导序列的裂解酶，从而使Nisin具有生物学活性；且nisR与nisK基因与合成Nisin的双调控系统有关，能够调控Nisin生产量，汪蕊等对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)N401的nisRK基因超表达后发现，N401的Nisin Z的产量大幅提高。

目前有研究表明nisI和Nisin的自身免疫机制有关，并且发现这一过程是通过nisI编码的一种脂蛋白nisI实现的。

nisI能够和Nisin结合或促使Nisin产生菌细胞聚集成链状，从而隔断Nisin和类脂接触，nisI和nisFEG蛋白的协同作用保证了Nisin的自身免疫效果，使Nisin产生菌得到保护。

Ⅱ类细菌素中最为常见的细菌素为片球菌素。

片球菌素由戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)分泌，在细菌素分类中属于Ⅱa类细菌素。

迄今为止筛选出的所有乳酸菌细菌素中，片球菌素具有最为稳定的理化性质，能够抑制多种病原菌的生长和繁殖，尤其是对于单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)有较强抑制作用。

现如今常见的片球菌素主要有片球菌素PA-1、戊糖片球菌素PPK34、戊糖片球菌素L5-6等。

片球菌素的生成受pedA、pedB、pedC、pedD四个基因的调控。

其中pedA编码合成片球菌素的前体,pedB调节免疫球蛋白的生成，pedC调控生成的酶促进多肽成熟，pedD编码生成用于转运片球菌素的ABC转运蛋白pedD。

植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum NC8)所生产的细菌素Plantaricin NC8为Ⅱb类细菌素，其前体多肽由plNC8α和plNC8β负责编码，而前体多肽到Plantaricin NC8的修饰过程需要自诱导或共培养来促进。

屎肠球菌(Enterococous faecium)150所产生的细菌素Enterocin Q为Ⅱc类细菌素，由entqA、entqB、entqC调控生成，其中entqA编码结构多肽，entqB编码ABC转运蛋白，entqC编码免疫蛋白。

本课题组在之前对副干酪乳杆菌细菌素Paracin1.7的研究中发现，该细菌素不含有阳离子氨基酸，且具有较强的抑菌活性，可以确定其属于IId细菌素。

Ⅲ类细菌素生物合成机制相关研究少，目前已知的Ⅲ类细菌素均具有区域性结构和易位功能，不同的区域能够通过和细菌受体结合从而发挥其抗菌活性。

Ⅲ类细菌素在作用过程中能够促进细菌的细胞膜发生溶解，故又名溶菌素。

然而其具体的作用机制相对模糊，有待进一步研究和探讨。

共培养调节乳酸菌产细菌素

共培养对乳酸菌产细菌素的调控

目前，乳酸菌纯培养生产的细菌素产量较低，已有研究表明，以共培养作为环境条件能够诱导乳酸菌产生细菌素，并且能够在一定程度上增加乳酸菌细菌素的产量。

共培养一般是指将两种或两种以上细胞或菌株按照一定的比例放置在同一体系中混合培养，在共培养的过程中通常伴随着协同代谢以及群体感应等错综复杂的微生物种间关系，共培养的菌株之间能够通过直接接触以及分泌信号分子等方式来促进双方生理形态以及代谢物产量的变化，例如细菌素、有机酸、酯类化合物、乙偶姻等。

研究表明，将乳酸菌和唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)等进行共培养后，细菌素产量明显增加。

CAROLINA等对两种细菌进行共培养，细菌素产量显著高于戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)147单独培养，证明乳酸菌共培养可以作为诱导细菌素产量增加的方法。

满丽莉等将植物乳杆菌(Lactobacillus.Plantarum) KLDS1.0391与76株乳酸菌分别共培养，其中几种乳酸菌与L.plantarum KLDS1.0391共培养后，L.plantarum KLDS1.0391的活菌数显著增加，抑菌活性增加。

以上结果表明，共培养能够在一定程度上增加细菌素的产量。

对于共培养如何提高细菌素产量，通过WORAPRAYOTE等的研究发现，一方面是无细菌素活性菌株通过产细菌素活性因子刺激处于感受态的有细菌素活性菌株，使其增加了细菌素的产量。

另一方面则是无细菌素活性的菌株在有细菌素活性的菌株的诱导下产生了细菌素活性。

MALDONADO等研究发现植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NC8只有与特定的革兰氏阳性细菌共培养时才能产生植物乳杆菌素PLNC8，该结果表明特定的革兰氏阳性细菌的存在作为一种环境刺激，激活了L.plantarum NC8产生PLNC8。

细菌共培养不仅能够促进细菌素的产生，也有一些细菌在共培养条件下会互相抑制对方的细菌素活性，使细菌素产量大幅下降。

JESÚS等对植物乳杆菌(Lactobacillus.Plantarum)NC8C和屎肠球菌(Enterococcus faecium)6T1a两种产细菌素的细菌进行共培养，结果发现两种菌株细菌素的产生受到抑制，且这种现象于其他食品发酵乳酸菌共培养中也存在。

这种细菌素水平的降低不是由于存活细菌数量减少，也不能归因于共培养细菌分泌细胞外蛋白水解酶降解了细菌素。

产生这种情况的原因一方面是共培养菌株有细菌素抗性或敏感性。

也就是说，若将产细菌素菌株和对其细菌素有抗性的菌株放在一起进行共培养，其必然导致细菌素产量下降。

另一方面是乳酸菌和共培养菌株之间复杂的群体感应系统所导致的，不同菌株的活性导致其在群体感应过程中产生的信号分子的活性产生了变化。

以上结果表明，共培养促进或是抑制产细菌素菌株的细菌素活性是由共培养菌株决定的。

常见的细菌素的抑菌谱较窄，共培养产生的细菌素在抗菌范围方面的提升也极其有限，但可以通过和其他抗菌物质联合使用从而增强其抗菌活性。

佳木泰等从乳制品中分离得到的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)Q-1-4所产生的细菌素与EDTA、SDS共同作用时，其抑菌性明显比单独使用L.paracasei Q-1-4所产细菌素时更强。

此外，有关乳酸菌所产细菌素抑制真菌的报道较少，但副干酪乳杆菌产生的细菌素可抑制某些酵母菌，如白色假丝酵母(Candida albicans)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等，能够较好地预防食物腐败以及毒枝菌素的生成，因此在食品发酵及防腐、环境保护都具有良好的发展前景。

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