文献速递

加拿大 CHILD 队列中收集的出生 3 月后的母乳和婴儿粪便和出生 1 年后的婴儿粪便的 16S 微生物分析以研究母乳及喂养模式对母乳中的微生物传递到婴儿肠道这一过程的影响。结果显示，1）婴儿肠道微生物组成，多样性和其成熟与母乳喂养排他性（比例，即纯母乳，部分母乳，不再母乳喂养）和持续时间相关，与瓶喂没有关系。2）特有的婴儿肠道微生物与母乳喂养排他性和持续时间相关。3）母乳和婴儿微生物组成各异，但母乳和其孩子肠道共享某些菌。4）母乳和婴儿肠道共享细菌程度与母乳喂养方式有关，母乳瓶喂会减少共享菌，同时共享菌丰度也会降低。5）母乳和婴儿肠道普遍的共享菌与婴儿肠道微生物组成有关，母乳细菌导致肠道菌群整体变化与分娩方式等其它影响因素相似。

Keywords: breastmilk; human milk; Breastfeeding; Infant Gut; CHILD Cohort Study

Title: Breastmilk Feeding Practices Are Associated with the Co-Occurrence of Bacteria in Mothers’ Milk and the Infant Gut: the CHILD Cohort Study

DOI: 10.1016/j.chom.2020.06.009

Journal: Cell Host and Microbe [IF 15.923]

First Authors: Kelsey Fehr, Shirin Moossavi, Hind Sbihi, Rozlyn CT Boutin

Correspondence: B Brett Finlay, Stuart E Turvey, Meghan B Azad

Affiliation: Children’s Hospital Research Institute of Manitoba and Developmental Origins of Chronic Diseases in Children Network (DEVOTION), Winnipeg, MB, Canada

Published: 2020-07-11

研究背景

生命早期肠道菌群的发育会影响长期健康，而母乳喂养是影响这一过程的最有影响力的因素之一。

先前研究表明，婴儿肠道菌群成分取决于细菌在肠道中定植的类型和顺序。分娩时的母亲的阴道和粪便微生物首先定植于新生儿的胃肠道，随后母亲和其他家庭成员的身体微生物和环境中微生物都有可能转移定植。但是对于母乳中微生物对这过程的作用鲜有研究。只有少数研究关注了母乳和婴儿粪便的共享微生物，但都集中在某一种特定的物种，没有全局评估母乳微生物的影响，也没有考虑那些已知的婴儿微生物修饰因子。

虽然已知母乳对婴儿肠道微生物的影响，但不同的母乳喂养方式对其影响却鲜有人知，尤其是现在母乳瓶喂（泵出母乳，再通过奶瓶喂）越来越受妈妈的喜爱，但尚未有文章评估这种喂养模式对婴儿肠道微生物的影响。

本研究探索的问题：

• 人乳细菌与婴儿肠道微生物组成关系；
• 母乳喂养习惯（方式）对婴儿肠道微生物影响；
• 与婴儿微生物组的其他已知修饰因子相比，人乳细菌的相对重要性。

研究思路

文章提到的分组情况：

• 母乳喂养状态划分为纯母乳喂养； 部分母乳喂养（母乳+配方） 或不再母乳喂养.
• 母乳喂养方式分为 “总是直接母乳喂养” 和 “偶尔奶瓶喂养（过去2周至少使用1次奶瓶喂养）”
• 是否母乳喂养满一年，分为：Yes持续任何母乳喂养；No 未满一年停止了母乳喂养。
• 母乳喂养时间分为：小于3月（>0-3）, 3-9. 9-12 或 ≥ 12 月。
• 母亲年龄、婴儿性别、出身体重、胎龄、出身方式（剖腹产、自然分娩）、胎次、分娩抗生素使用，均从医院记录中提取。

研究结果

1. 队列概貌

从 CHILD 队列中收录了 1,249 母婴对。队列中，持续母乳喂养时间为 9.4 ± 3.3 months（纯母乳喂养时间 3.3 ± 2.3 months）；婴儿出生 3-4 月后的家访时，61% 的母亲会瓶喂；其中，新手妈妈比例 56%；剖腹产比例25%；大部分的顺产的多胎（非头胎）的妈妈会选择纯母乳喂养。

2. 婴儿肠道微生物组成，多样性和其成熟与母乳喂养排他性和持续时间相关，而非瓶喂。

首先是 RDA 分析比较母乳喂养方式与肠道微生物组成关系。

出生 3月 后，不再母乳喂养与纯母乳喂养和部分母乳喂养显著不同，纯母乳喂养和部分母乳喂养有略微的差异(图 1A)。在多元校正模型中，母乳喂养排他性解释了大部分的差异相较于于其他因素（出生方式，是否有哥哥姐姐，是否适用抗生素）。

3 个月时，无论是单因素还是校正后，母乳喂养模式（亲喂或瓶喂）与肠道微生物 (图 1B)、多样性或微生物群成熟 (图 1E) 没有关系。但是不再母乳喂养的肠道微生物多样性更大和成熟更快一些，相较于母乳喂养的两组 (图 1D).。

1 年后，单因素或校正模型中，母乳喂养持续时间都解释了 1.01% 的肠道微生物组成差异(图 1C)。

母乳喂养 1 年后较 3 个月的时候，物种多样性均增加，无论持续母乳喂养时间多长，但是 3 月时就不再母乳喂养的话，多样性没有增加，肠道微生物群落的成熟也有类似结果(图 1G)。

综上所述，肠道微生物多样性对母乳有剂量依赖效应，非母乳喂养的婴儿的肠道微生物更早更快地成熟和多样。

图1. Infant Gut Microbiota Composition, Diversity, and Maturity Are Associated with Breastmilk Feeding Practices

3. 特有的婴儿肠道微生物与母乳喂养排他性和持续时间相关

3 个月时，母乳喂养与非母乳喂养的肠道微生物的物种丰度有差异 (图 2A)。3 月时，纯母乳喂养和不再母乳喂养之间有12个差异物种（4个富集纯母乳喂养（Haemophilus parainfluenzae, Streptococcus 3, 2个Veillonella dispar）；8 个富集不再母乳喂养（Blautia, Streptococcus 2和 2个 unclassified Lachnospiraceae 2,3）），这 12 个物种中，其中 6 个在纯母乳喂养组和部分母乳喂养组之间也差异。母乳喂养模式与物种丰度没有关系，即便是纯母乳喂养。

一年后，4 个普遍物种富集在母乳喂养组（包括 H. parainfluenzae 和 V. dispar），5 个物种富集在中断母乳喂养组（Dorea, 和 2 个 unclassified Lachnospiraceae(2,3)）Bifidobacterium bifidum 富集在母乳喂养组，但是其他注释的 Bifidobacterium 没有差异。

作者还评估了其他可能影响因素。3月时，Bacteroides 在剖腹产小组中减少。1年后，是否有哥哥姐姐这因素与19 个物种相对丰度有很强的关联，包括 B. bifidum 和 Bifidobacterium(2) (图 2B)。

图2. Specific Bacteria in the Infant Gut Are Associated with Breastmilk Feeding Practices

4. 母乳和婴儿微生物组成各异，但母乳和其孩子肠道共享某些菌

在母乳和婴儿粪便的普遍的属大部分都不相同，只有 Streptococcus 和 Veillonella 都存在超 60% 两种样品中。总的来说，母乳中主要是 Streptococcus 和 Staphylococcus；婴儿肠道主要是 Bifidobacterium 和 Bacteroides(图 3A)。真实 3 月的母乳& 3 月时的婴儿肠道对比随机配对的 3 月的母乳 & 3 月的婴儿肠道对更像，但是真实 3 月的母乳 & 1 岁时的婴儿肠道对与随机配对的没有差异 (图 3B)。

接着，评估单个 ASVs 配对共享情况。在 3 月中普遍共享的 ASVs 包括 Streptococcus(2) (shared in 61.4% of dyads), V. dispar (35.6%), Staphylococcus (30.7%), 和Bifidobacterium (27.1%) (图 3C)。在全部的母乳样品或者全部婴儿粪便样品*共中**享 ASVs 个数和程度更大 (图 3D)。真实的母婴对在 3 月或 1 年都更有可能共享 5 个或者更多的 ASVs，相较于随机配对 (图 3E)。这就支持了母乳与其孩子肠道之间共享一些细菌的假说。

进一步，分析这些共享菌在母乳和婴儿肠道相对丰度关系。总的来说，在 3 月时，同一 ASV 在母乳和婴儿肠道都是正相关，其中 8 个是显著关联，分别是 Rothia mucilaginosa, 3 个 Streptococcus ASVs 和 1 个 Actinomyces ASV，但非同 ASV 之间关联就比较弱，156 关系对中只有 8 对显著关联（6 + 和 2 -），其中 2 个未分类的 Streptococci 之间存在负相关。3 月母乳样品和 1 年的婴儿肠道没有任何显著关联(图 4)。

图3. Infant Gut and Milk Microbiota Are Distinct But Some Bacteria Are Shared between a Mother’s Milk and Their Own Infant’s Gut

图 4. Commonly Shared Bacteria Are Correlated between a Mother’s Milk and Infant’s Gut

5. 母乳和婴儿肠道共享细菌程度与母乳喂养方式有关

下一步，作者分析了母乳喂养方式与母乳和婴儿肠道共享细菌程度的关系。结果显示，3 个月时，母乳喂养排他性并没有和共享 ASV 个数有关，但是和喂养方式有关，亲喂比瓶喂共享 5 个 ASV 以上的比例更高。母乳喂养一年共享 5 个 ASV 以上的比例比母乳喂养不到一年的更高 (图 5A)。3 月母乳中，亲喂模式比瓶喂模式中的 V. dispar , H. parainfluenzae , Streptococcus(3) 和 Bifidobacterium sp. 丰度更高，出现频率更高，但是 3 月婴儿肠道中没有观察到物种丰度差异(图5B)。相反，关于母乳的排他性，母乳*共中**享 ASV 出现频率和排他性很有有关联，但是在婴儿肠道中这种关联就比较多，H. parainfluenzae, R. mucilaginosa, Staphylococcus, 和 Streptococcus(3) 母乳喂养比未曾母乳喂养出现频率和相对丰度更高；反之，2 个Streptococcus ASVs, 和1 个 Actinomyces 则出现频率和相对丰度更低(图 5C)。R. mucilaginosa 没有出现在未曾母乳喂养组，但在不再母乳喂养组，部分母乳喂养组，纯母乳喂养组的出现频率逐渐升高。

总的来说，似乎母乳喂养方式影响母乳的共享菌，而母乳喂养的排他性影响婴儿肠道的共享菌。

再来，母乳喂养持续时间与母乳喂养的排他性有类似的结果，H. parainfluenzae, V. dispar 和 Veillonella parvula 随着母乳时间增加出现频率增加，其中 H. parainfluenzae 和 V. dispar 的相对丰度也与母乳喂养时间正比(图 5D)。

图5. Breastmilk Feeding Practices Are Associated with Shared Bacteria in Milk and the Infant Gut

6. 母乳和婴儿肠道普遍的共享菌与婴儿肠道微生物组成有关

作者假设，至少一些普遍的共享菌有能力转移到婴儿肠道并影响整个肠道微生物构建。作者用 RDA 分析来验证这一假设。选用 13 个普遍共享ASVs 和 10 个非共享 ASVs 作为母乳喂养婴儿肠道菌群组成变化的可能来源，结果显示， 共享菌能解释 3 月和 1 年肠道微生物的差异的 1.04% 和 0.55%，而非共享 ASV 只能解释 1 年的肠道微生物的差异的 0.4%， 很明显，共享 ASV 比那些已经会影响肠道微生物群落的因子（母乳排他性 (纯母乳vs 部分, 0.76%), 出生方式 (0.87%), 分娩抗生素使用(0.72%), 哥哥姐姐 (0.58%)）更能解释这差异(图 6A)。

最后，调查了母乳中的共享菌对婴儿肠道微生物差异贡献，结果显示，Streptococcus(4), Streptococcus(2) 和 Bifidobacterium 与 3月婴儿肠道有关系，但只有 Bifidobacterium 和 Streptococcus(2) 在1年时仍有显著关联(图 6B)。

图6. Bacteria in Milk Are Associated with Infant Gut Microbiota Composition with a Strength Comparable to Other Factors in Early-Life

结果与讨论

文章总结：

通过母乳可以讲母亲或外源微生物转移到婴儿肠道，早期断奶或者母乳瓶喂都会影响这个过程。母乳的排他性和持续时间是婴儿肠道微生物群落的主要驱动力，依据：1）尽管母乳和粪便微生物结构差异很大，但是真实的母婴对的两者之间的细菌有关联 2）一些共享菌与母乳喂养习惯相关 3）在母乳中常见的共享菌影响婴儿肠道整体微生物群落，独立于其他生命早期因子，例如 HMOs 和出生方式。

文章议点：

母乳喂养模式塑造了婴儿肠道微生物并影响母婴共享菌

• 母乳瓶喂会减少母婴共享的细菌数，可能原因是瓶喂过程中的吸取，储存，冷冻，融化等过程可能对微生物造成影响。未来研究可以更关注于母乳，口腔，婴儿肠道之间从纵轴研究。

母乳细菌可能时婴儿肠道微生物的种子并影响其健康

• 值得注意的是没有一个细菌在所有母婴对中都共享，这提示了个体差异。
• 队列先前研究也观察到瓶喂与哮喘和肥胖之间有微弱的关联，可能原因是共享母亲微生物少了。
• 同时，共享那些细菌大部分与免疫系统稳态有关。例如 Bifidobacterium spp. 能降解 HMOs, 好些菌都能产生SCFAs。

母乳细菌影响婴儿肠道微生物群落独立于人母乳低聚糖

但是本研究很难直接评估其他影响因子（出生方式，分娩抗生素使用）这些都是采集样品之前就发生了。

文章缺陷：

• 缺少 1 年的母乳样品，因此限制了 1 年时母婴共享菌的分析。
• 数据虽然都是来自 CHILD 队列，采用相同的引物，分析流程，但样品在多个中心处理分析。
• 调查问卷少了关于母乳喂养方式详细信息调查，如 母乳或配方奶粉喂养的比例和频率，亲喂和吸奶的频率等）这限制了对喂养模式的研究。
• 本研究还少了母亲皮肤、婴儿口腔的样品，因此不能分析它们对婴儿肠道群落影响。

M菌笔记

• 母乳喂养比例与婴儿肠道微生物相关，非母乳喂养或者3月之前就不再母乳喂养的婴儿肠道微生物更早更快地成熟和多样。
• 直接母乳哺乳比瓶喂婴儿肠道能共享更多母乳中细菌，和这些共享菌丰度越高，这些菌与宿主的免疫稳态和SCFA生成有关系。
• 母婴共享菌能解释部分婴儿肠道差异。

参考文献

Fehr K, Moossavi S, Sbihi H, et al. Breastmilk Feeding Practices Are Associated with the Co-Occurrence of Bacteria in Mothers’ Milk and the Infant Gut: the CHILD Cohort Study[J]. Cell Host & Microbe, 2020.